중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)은 SRAS Coronavirus(SARS CoV)에 의해 발생되는 호흡기 질환이다[1]. SARS CoV는 단일가닥의 (+)RNA를 유전물질로 한다[2]. 유전물질의 복제 및 발현에 관여하는 helicase는 주요한 항바이러스제 제조의 목적 물질로 주목되고 있다[3]. Helicase는 NTP 분해 시 얻어지는 화학적 에너지를 이용하여 핵산(nucleic acid)을 타고 움직이는 motor protein으로 virus를 포함한 많은 생물체들이 갖고 있는 효소이다. Helicase는 DNA나 RNA 또는 DNA와 RNA로 이루어진 이중가닥을 단일가닥으로 풀어주는 효소이다.본 논문은 1년 내에 8천여 명을 감염시킬 만큼의 높은 전파속도와 감염자 중 9.6%가 사망하는 높은 사망률을 가진 SARS CoV의 원인균의 helicase에 대한 연구이다. 본 연구는 SARS CoV helicase의 발현과 정제, 특성 분석을 주제로 한다. 대장균에서 발현하고 N-말단에 있는 hexahistidine을 이용하여 정제한 이 효소의 ATP 가수분해 및 DNA 풀림활성과 올리고머(oligomer) 형성에 대한 연구를 담고 있다. 대장균에서 발현하여 Ni-IDA와 gel filtration column을 이용하여 정제하고 SDS-PAGE로 확인하였다. ATP를 사용하여 가수분해 활성을 확인하는 실험을 여러 가지 기질 및 여러 가지 반응용액(buffer)에서 실행하였다. 기질은 크게 RNA와 DNA를 사용하였다. SARS CoV는 RNA virus 이므로 poly(rU)와 poly(rC)를 이용하여 ATP 가수분해 활성을 확인하였다. 같은 base 길이를 가지는 RNA와 DNA를 이용하여 가수분해 속도를 비교하였을 때 기질이 DNA인 경우 더 높은 V_(max) 값을 나타냈다. SARS CoV helicase의 ATP 가수분해 활성을 핵산의 길이나 서열에 따라 어떻게 달라지는 가를 확인하기 위해 길이가 20~90base에 이르는 random sequence의 ssDNA를 이용하였고, ssDNA의 길이에 따라 ATP 가수분해 속도가 더 빨라지는 것을 확인하였다. 같은 길이 범위에서 oligo dT로만 이루어진 DNA를 이용하여 실험을 반복한 결과 서열에 대한 특이성은 가지지 않는 것으로 확인하였다. SARS CoV helicase는 이미 연구 된 바 5'에 over hang을 갖는 dsDNA의 경우에만 활성이 있으므로 5‘ over hang을 포함하는 dsDNA를 디자인 하고, over hang의 길이를 0~20base로 다르게 하여 풀림 활성(unwinding activity)을 시험하였다[4]. 시험 결과 5~10base 정도의 over hang 길이가 있어야 SARS CoV helicase와 결합하여 이중가닥이 풀릴 수 있다는 것을 확인하였다. ATP 가수분해 실험 중 oligomer를 형성할 수 있다는 가설을 세우고 HPLC(high Presser liquid chromatography)를 이용하여 단백질의 분자량에 따라 달라는 elution time을 측정하였다. 여러 가지 반응용액의 조건에 따라 helicase가 hexamer에 가까운 분자량을 가지는 경우를 발견하였다.
Severe acute respiratory syndrome (SARS) is characterized by influenza-like symptoms, high fever, myalgia, dyspnea, lymphopoenia and lung ingiltrates, which leads to acute breathing problems. The etiology of SARS was identified as a novel coronavirus, SARS coronavirus (SARS CoV). SARS CoV is single-stranded RNA positive-strand virus with a genome of ~30kb. According to the World Health Organization, as of the 2003, the death rate due to SARS CoV is 10%. The main proteinase (M^(pro)), the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), and the NTPase/helicase (Hel) are essential proteins for virus life cycle and for the development of anti-SARS drugs.Helicases play important roles in viral life cycle, such as translocation and nucleic acid strand separation. Helicases are motor enzymes that use energy derived from NTP hydrolysis to unwind double-stranded nucleic acids. SARS CoV helicacse has ATP hydrolysis activity and double-stranded nucleic acid unwinding activity. This paper shows that SARS CoV helicase has ATP hydrolysis activity with ssRNA(polyU, polyC, random sequence 90base ssRNA), ssDNA(random sequence 20, 30, 40, 50, 60, 90base ssDNA, oligo dT 20, 30, 40, 50, 60base ssDNA) and dsDNA unwinding activity with including 0T, 5T, 10T, 15T, 20T overhang covalently attached to dsDNA. And we performed oligomerization studies of SARS CoV helicaseby HPLC(high performance liquid chromatography).