Human breast milk, unlike other mammals, has a fairly high concentration of oligosaccharides, Up to date, about 200 types of human milk oligosaccharides (HMOs) have been identified, in which fucosylated oligosaccharides dominate. Fucosylated oligosaccharides have various biological activities including prebiotic effects, modulation of immune response, reduction of inflammatory processes, and prevention of pathogenic infection. Among the several types of fucosylated oligosaccharides difucosyllactose (Di-FL) has strong antimicrobial activity, and hence can be used as a health functional food material and pharmaceutical formula.Generally, Escherichia coli does not secrete recombinant proteins into the culture medium. Therefore, It sought to develop a novel strategy to enhance the secretion efficiency of target proteins in this study. To this end, phospholipase A2 (PLA2) from Streptomyces violaceoruber, a truncational mutant-1 (TM1) of CelA from Caldicellulosiruptor bescii, and Cel48S from Clostridium thermocellum were selected as model proteins to determine the optimum secretion pathway. Also, the E. coli BL21 star (DE3) ΔLFAR-YA strain constructed previously for production of 2’-fucosyllactose (2-FL) was employed for production of Di-FL. It was hypothesized that the translocation of L-fucokinase/GDP-L-fucose pyrophosphorylase (Fkp) from Bacillus fragilis and α-1,2-fucosyltransferase (FucT2) from Helicobacter pylori, the enzymes involved in FLs production, into culture medium could enhance production yield of FLs.The extracellular PLA2 activity obtained via the SecB pathway (PelB-PLA2) was 25.3-fold higher than that obtained via the signal recognition particle (SRP)-dependent pathway, indicating that the SecB pathway was suitable for expression and secretion of PLA2 in E. coli. However, the extracellular specific activities of TM1 obtained via the SRP pathway (DsbA-TM1) were 1.8-fold (on CMC) and 2.5-fold (on Avicel) higher than those obtained via the SecB pathway. Also, the extracellular specific activities of Cel48S obtained via the SRP pathway (DsbA-Cel48S) were 2.0-fold (on CMC) and 1.8-fold (on Avicel) higher than those obtained via the SecB pathway, these results suggested that the SRP pathway was suitable for successful production of TM1 and Cel48S in E. coli. Therefore, the optimal secretion pathway for each model protein was established.To transport Fkp and FucT2 enzymes, either of PelB-PLA2 or DsbA-TM1 was co-expressed with Fkp and FucT2 because expression of PelB-PLA2 or DsbA-TM1 led to non-specific secretion of proteins in E. coli. Interestingly, the engineered E. coli co-expressing Fkp, FucT2, and PLA2 produced 1.020 ± 0.002 g/L of Di-FL whereas production of Di-FL by the control strain overexpressing Fkp and FucT2 was not detected. These results suggest that engineered E. coli constructed in this study can be employed for the production of Di-FL.
인간의 모유는 다른 포유류와 달리 상당히 높은 농도의 올리고당을 함유하고있다. 현재까지 약 200여 종류의 모유올리고당 (HMO)이 확인 되었으며 푸코실화된 올리고당이 대부분을 차지한다. 푸코실화된 올리고당은 프리바이오틱 효과, 면역 반응 조절, 염증감소, 병원성 감염 예방 등 다양한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 여러 종류의 푸코실화된 올리고당 중에서 다이푸코실락토오스 (Di-FL)은 항균력이 강하여 건강기능성 식품소재 및 의약품 제제로 활용이 가능할 것이다.일반적으로 대장균은 재조합 단백질을 세포외로 분비하지 않는다. 따라서 본 연구에서 표적 단백질의 분비 효율을 높이기 위한 새로운 전략을 개발하고자 하였다. 이를 위해 Streptomyces violaceorubur 유래의 phospholipase A2 (PLA2), Caldicellulosiruptor bescii 유래의 a truncational mutant-1 (절단형 돌연변이, TM1) 그리고 Clostridium thermocellum 유래의 Cel48S를 모델 단백질로 선정하여 최적의 분비 경로를 결정하였다. 그리고 이전에 2’-푸코실락토오스 (2-FL) 생산을 위해 구축된 E. coli BL21 star (DE3) ΔLFAR-YA 균주를 다이푸코실락토오스 생산에 사용하였다. 푸코실락토오스 생산에 관여하는 효소인Bacillus fragilis 유래의 L-fucokinase/GDP-L-fucose pyrophosphorylase (Fkp) 효소와 Helicobacter pylori 유래의 α-1,2-fucosyltransferase (FucT2) 효소가 배지로 분비되면 푸코실락토오스의 생산 수율을 향상시킬 수 있다는 가설을 세웠다.SecB 분비 경로 (PelB-PLA2)를 통해 얻은 세포외 PLA2 활성은 SRP 분비 경로를 통해 얻은 것보다 25.3배 더 높았으며 SecB분비 경로가 대장균에서PLA2의 발현 및 분비에 적합했음을 나타냈다. 그러나 SRP분비 경로 (DsbA-TM1)를 통해 얻은TM1의 세포외 특이활성도는 SecB 분비 경로를 통해 얻은 것보다 CMC에서 1.8배, Avicel에서 2.5배 더 높았다. 또한 SRP 분비 경로 (DsbA-Cel48S)를 통해 얻은 Cel48S의 세포외 특이활성도는 SecB분비 경로를 통해 얻은 것보다 CMC에서 2.0배, Avicel에서 1.8배 더 높았으며, 이러한 결과는 SRP 분비 경로가 대장균에서 TM1 및 Cel48S의 성공적인 생산에 적합하다는 것을 나타내었다. 따라서 각 모델 단백질에 대한 최적의 분비 경로가 확립되었다.또한, PelB-PLA2 또는 DsbA-TM1의 발현은 대장균에서 단백질의 비특이적 분비를 유도했기 때문에 PelB-PLA2 와 DsbA-TM1은 Fkp 및 FucT2 효소를 수송하기 위해 공발현하였다. 흥미롭게도 Fkp, FucT2 및PLA2를 공발현하는 재조합 대장균은 1.020 ± 0.002 g/L의 다이푸코실락토오스를 생산 한 반면, Fkp 및 FucT2를 과발현하는 대조군 균주에 의한 다이푸코실락토오스의 생산은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 본 연구에서 제작된 재조합 대장균이 다이푸코실락토오스 생산에 사용될 수 있음을 시사한다.