Bacterial Obg subfamily proteins fundamentally play a role in the process of ribosome assembly or maturation. Recently, they were reported to regulate the activity of SpoT, a ribosome-associated stress response protein, which maintains the low (p)ppGpp level under nutrient-rich environment. Interestingly, plant also has a bacterial Obg-like protein, and moreover, AtObg1 as an Arabidopsis Obg1 showed similar biochemical properties with typical Ras-like GTPases in GTPase activity, and moreover, was found to be localized to chloroplast. In spite of these, its function in plant is almost not clear yet. Here, we report the functional characterization of plant AtObg1 at chloroplast development and in (p)ppGpp signaling. The AtObg1 RNAi mutants showing decrease of AtObg1 mRNA occurred chlorosis of Arabidopsis cotyledons, and then, transmission electron micrographs showed abnormal morphologies of their internal substructure of chloroplasts, indicating that AtObg1 may play an important role in chloroplast development. Besides these, yeast two-hybrid analysis showed that AtObg1 could interact strongly with the AtRSH1, an Arabidopsis homolog of bacterial SpoT, and their interaction was further supported by the RT-PCR data, showing the similar expression patterns between AtRSH1 and AtObg1. Moreover, mapping on binding sites between AtObg1 and RSH1 showed that all parts of AtObg1 including Obg fold, GTP-binding and TGS domain were important to interact with RSH1, and especially, implied that the interaction was dependent on the guanine nucleotide binding status of AtObg1. The mapping also showed that TGS domain at the RSH1 was essential for their interaction, supporting the hypothesis obtained by the preliminary docking simulating model method to predict structural binding between AtRSH1 and AtObg1. Taken together, we propose that in chloroplast, AtObg1 may be involved in chloroplast development and regulate the (p)ppGpp level by interacting with AtRSH1, as bacterial Obg proteins do.
영양분이 부족한 환경이 되면, 박테리아는 Alarmone, 즉 (p)ppGpp분자를 합성하여 세포 내에 축적하게 되는데, 증가된 (p)ppGpp는 RNA polymerase와 결합하여Stringent response와 관련된 유전자의mRNA합성을 조절한다. 한편, 환경이 정상적인 상태로 회복되면, 박테리아는SpoT 단백질을 사용하여 증가되어 있는 (p)ppGpp분자를 분해하고 그 양을 적정한 수준으로 줄인다. 이 과정에서 Obg단백질은 SpoT 단백질의 (p)ppGpp 분해 활성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 박테리아 유래의Obg와SpoT 단백질의 아미노산서열 정보를 이용하여 식물체인 애기장대의Protein database에서 AtObg1과 4개의 RelA/SpoT homologs (AtRSH1, AtRSH2, AtRSH3, and CRSH)를 선별하였으며, 특히, 이미 이전에 식물의 엽록체 내에도 (p)ppGpp분자가 존재 한다는 사실을 보고한 논문을 바탕으로, 식물의 엽록체 내에도 박테리아의 (p)ppGpp 신호전달과정과 유사한 과정이 있을 것으로 미루어 생각하였다. 식물체 내에도 (p)ppGpp 매개 신호전달과정이 존재하는지를 알아보기 위해 모델식물인 애기장대 엽록체로부터 AtObg1와RelA/SpoT homolog를 분리하고 이들의 생화학적, 분자생물학적 연구를 수행한 결과를 소개하고자 한다. 먼저 생화학적 방법으로 AtObg1이 G-protein으로서 P-loop GTPase superclass 에 속함을 입증하기 위해GTP-binding과 hydrolyzing분석을 행하였으며, 또한, 형광현미경으로 AtObg1은 식물세포 내의 엽록체에 위치함을 확인하였다. 그리고AtObg1의 생리적인 기능을 알아보기 위해서 이 유전자의 RNAi mutant를 만들고, 그 phenotype을 관찰한 결과, mutant의 cotyledon이 chlorosis를 보였고, 전자현미경으로 관찰한 세포내부는 특히, 엽록체의 발달이 크게 저해되었음을 보여주었다. 이러한 결과는 AtObg1 이 엽록체 발달과정에 있어서 매우 중요한 유전자임을 시사 하였다.다음으로, 박테리아에서처럼 AtObg1 단백질이AtRSH와 결합할 수 있는지를 조사해 보았다. 애기장대 유래의 4종류의AtRSHs (AtRSH1, AtRSH2, AtRSH3, and CRSH)와 AtObg1을 사용하여 수행한 Yeast two-hybrid assay에 의해, 위의 4종류의 AtRSHs 중 AtRSH1이 AtObg1과 가장 강하게 상호작용함을 알 수 있었다. 특히, 계통학적 분석을 통해4종류의AtRSHs중에서 흥미롭게도AtRSH1의 아미노산 서열이 박테리아 SpoT의 아미노산 서열과 매우 유사함(60 %)을 알 수 있었으며, 이로써AtRSH1은 식물의 SpoT와 상동체임을 추정 할 수 있었다. AtRSH1과의 결합에 있어서 AtObg1의 어느 부위가 실질적으로 관여하는지 좀 더 상세하게 알아보기 위해 Yeast two-hybrid assay를 수행하였다. 그 결과 AtObg1의 Obg fold, G domain, TGS 들은 모두AtRSH1과의 결합에 있어서 중요한 부위 임을 알 수 있었으며, 이는 박테리아의 경우와 유사하였다. 또한, AtObg1의 Point mutant 들을 사용하여 행한 상호작용 실험에서 AtObg1의 G domain 의 구조 변화가 AtRSH1과의 결합에 영향을 미침을 보여 주었다. In vivo 조건에서AtObg1과 AtRSH1사이의 기능적 관련성을 알아보기 위해AtRSH1, AtRSH2, AtRSH3, AtObg1 유전자들의 Transcription pattern을 조사한 바, 특히 AtRSH1과 AtObg1이 매우 유사함을 알 수 있었다. 이상의 모든 결과를 종합하면, 식물의 엽록체 내에 존재하는 AtObg1과AtRSH1이 박테리아에서처럼 (p)ppGpp 매개 신호전달과정에 참여하고, 이 과정의 조절이 식물의 엽록체 발달 단계에 있어서 매우 중요한 역할을 담당할 것으로 생각된다.