目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性.方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的serpin,将其命名为arthropin;构建融合表达载体pSUMO3-arthropin,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;采用镍离子亲和层析、酶切、反向镍离子亲和层析、阴离子交换层析的4步层析纯化方案将arthropin重组蛋白分离纯化;将arthropin重组蛋白分别与活化的凝血因子Ⅸ(activated factor Ⅸ,FⅨa)、FⅩa、FⅪa、活化的蛋白C(activated protein C,APC)、激肽释放酶1(kallikrein 1,KLK1)等14种丝氨酸蛋白酶共孵育,再利用SDS-PAGE分析共价复合物形成情况,利用反应动力学方法检测arthropin对KLK1的抑制速率.对arthropin重组蛋白的结晶条件进行筛选,选取合适的晶体进行X射线衍射并采集数据.利用AlphaFlod Colab预测arthropin亚稳态结构模型.结果·SDS-PAGE分析发现,arthropin融合蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达;纯化后,获得了高纯度的与理论相对分子质量(45800)相近的arthropin重组蛋白.将arthropin重组蛋白与14种丝氨酸蛋白酶共孵育后发现,arthropin能与FⅩa、APC、FⅨa、FⅪa、胰蛋白酶(trypsin)、组织蛋白酶G(cathepsin G)、KLK1、KLK7和凝血酶(thrombin)9种蛋白酶形成稳定的共价复合物.Arthropin抑制KLK1的二级反应抑制速率常数为1.7×103 L/(mol·s).Arthropin重组蛋白可以在25%聚乙二醇单甲醚550(PEG MME 550)、0.1 mol/L吗啉乙磺酸(MES,pH 6.5)、0.01 mol/L ZnCl2条件下形成片状晶体,X射线衍射分辨率为10 ?(1 ?=1×10-10 m).AlphaFlod Colab预测结果发现,arthropin具有经典的抑制型serpin的结构特点.结论·成功获得高纯度的钝顶节旋藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin,其具有较广谱的丝氨酸蛋白酶抑制能力,但抑制速率较低.