DAU Library

학위논문 동서

Rhodobacter sphaeroides D-230이 생성하는 superoxide dismutase의 특성

김동식

부산: 동아대학교 1998. -

iii,43장: 삽도; 26cm. -

학위논문(석사)- 동아대학교 대학원 생물학과 전공 1998년2월

영문초록 : To extend the understanding of similar or different physiological properties of SOD and catalase from aerobic and anaerobic cultures, the various culture conditions were examined using Rhodobacter sphaeroides D-230. 500 activity from aerobe was getting higher when final pH was more than 9. Catalase activity was the same as SOD one. Paraquat was added to the liquid medium by dilution from sterile stock solution, with varying concentrations. Growth was inhibited by paraquat in both conditions. Over 2-fold increase only in SOD activity from anaerobic culture, was shown by addition of the paraquat to a final concentration 0.5 mM in comparison to aerobic culture, Paraquat seemed to argument intracellular production of O_(2) and this radical was likely to cause the induction of anaerobic SOD, but not of aerobic SOD, this implying that anaerobic SOD is a constitutive Mn-SOD. Catalase activity was induced by cyanide-resistance respiration in two culture conditions. About 2-fold increase from aerobic condition was shown by addition of the Fe^(2+), Fe^(3+), Fe^(2+)+Fe^(3+), but Mn^(2+) had little effect on the SOD activity from aerobic condition. It didn't know that owing to the deficient of the SOD produced from aerobic condition of the inhibition of SOD by the Mn(Ⅲ) ion. On the other hand, It was assumed an aspect of the reverse from anaerobic condition. In general aerobes and facultative anaerobes have Mn-SOD and/or Fe-SOD and anaerobe have Mn-SOD. Catalase activity from aerobes was higher in case of Mn^(+) addition than Fe group addition. In case of anaerobes, catalase activity was the same regardless of a different metal ion. Activity was not induced more than. This result was shown that our strain has typical catalase, the ferric state. In anaerobic condition, IC-SOD and catalase activity were increased till 33 hr incubation. EC-SOD activity washighly in stationary phase, but was quickly decreased after 33 hr incubation, the maximum point of It-SOD activity. The effect of several inhibitors, sodium azide(NaN_(3)), sodium cyanide(NaCn), and H_(2)O_(2), on the enzyme activity was examined with varying concentrations. Mn-SOD was inhibited by sodium azide(NaN_(3)) and CuㆍZn-SOD was inhibited by sodium cyanide (NaCN). NaCN didn't inhibited enzyme activity from both cultures. But, NaCN_(3) inhibited enzyme activity over 0.3 mM from anaerobic cultures. NaN_(3) had little effect on the activity of IC-SOD from aerobic culture, but was inhibited about 85 % on the activity of IC-SOD from aerobic culture. Particullary, the activity of SOD from both conditions were increased by sodium cyanide, the Inhibitor of Cu·Zn-SOD. The activity of catalase was extremely inhibited by NaCN and NaN_(3). This result is supported indirectly by the observation that the hydroperoxidase form In two culture conditions. As shown above, anaerobe SOD was concluded to be Mn-SOD from the results of physicoshemical properties. Aerobe SOD which was postulated to be Fe-type judging from the results of inhibitor test, metal supplement test. In this organism, the same apoSOD can accept either Fe or Mn to form the holoenzyme, which is named a cambialistic enzyme. On the contrary, stringent metal requirements are observed with SODs from Rhodobacter spheroids D-230, that is, inactive apoSOD by removal of metal is reconstituted only with the metal that was intrinsically bound to the holoenzyme. / 한글초록 : SOD의 생체내 역할을 밝히는 기초자료를 마련하기 위하여 통성 혐기성 광합성 세균인 Rhodobacter sphaeroides D-230을 이용하여, 산소의 존재 유·무 등과 같은 배양환경의 변화에 따라 SOD isozyme의 종류 및 특성과 catalase의 특성을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 배양 후 배양액의 pH가 8.5-9 일 때 호기적 배양과 혐기적 배양 두 조건 모두에서 SOD의 활성이 가장 높았으며, catalase는 두 조건 모두 중성부근에서 최고의 활성을 보였으며, 산성 pH 부위에서는 급격히 활성이 낮아졌다. Mn-SOD의 활성 유도제인 methyl viologen을 첨가했을 때 두 조건 모두에서 성장의 저해를 보였으며, 혐기적 조건에서만 0.5 mM의 첨가에서 IC-500가 약 2배 이상활성이 증가되어 Mn-SOD가 생성되는 것을 알 수 있다. Catalase의 활성은 두가지 배양조건 모두에서 cyanide 저항성 호흡에 의해 활성이 유도되는 것으로 사료된다. Fe^(2+), Fe^(3+), Fe^(2+)+Fe^(3+) 각각이 선택적으로 첨가되었을때 호기적 조건에서만 두배 이상 활성이 증가되어 Fe-SOD가 생성되는 것을 확인할 수 있으며, 혐기적 조건에서는 전체적인 활성이 낮아 금속이온의 추가적인 첨가에도 더 이상 활성이 유도되지 않는 것으로 사료된다. 500 isozyme의 활성 저해인 sodium azide (NaN_(3))와 sodium cyanide (NaCN)를 배양액에 첨가했을 때 NaCN은 두가지 배양조건에서 생성되는 효소 모두를 저해하지 않았으며, NaN_(3)는 혐기적 배양조건에서만 0.3 mM 이상에서 급격한 활성의 저해를 가져왔다. 추출한 효소액에 NaN_(3), NaCN, H_(2)O_(2)를 첨가하였을 때 호기적 조건에서 추출한 IC-SOD는 NaN_(3)에 의해 활성 저해가 적은 반면에, 혐기적 조건에서 추출한 IC-SOD는 NaN_(3)에 의해 활성 저해가 높았다. 혐기적 배양조건에서 Mn-SOD를 저해하는 NaN_(3)에 의해 효소의 활성이 저해되는 것으로 Mn-SOD가 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 특이하게, Cu·Zn-SOD의 저해제로 알려져 있는 NaCN에 의해서 두 조건에서 추출한 효소 모두가 활성이 증가되었다. Catalase는 NaCN와 NaN_(3)에 의해서 급격히 저해되는 것으로 보아 hydroperoxidase 종류인 것으로 추측되었다. 각 배양조건에서 정제한 효소는 호기적 조건과 혐기적 조건에서 각각 약 28 kDa와 22 kDa 의 분자량을 가지며, 모두 pH 7 부근에서 가장 안정적이었다. 혐기적 조건에서 추출한 SOD는 실온이상의 온도에서 안정성이 급격히 떨어짐을 알 수 있었다. 정제된 native An-SOD도 조효소와 마찬가지로 NaN_(3)에 의해 높은 활성의 저해를 받았으며, native A-SOD는 17 % 정도로 A-SOD 보다는 훨씬 적은 활성의 저해를 보였다. H_(2)O_(2)에 의해서는 native A-SOD 보다는 native An-SOD가 높은 불활성을 나타내었다 금속이온의 재구성 결과에서는 An-SOD와 A-SOD가 각각 Mn^(2+)와 Fe^(2+)에 의해서 활성이 복구되었다. 이상의 결과에 의해 두가지 배양조건에서 서로 다른 isozyme 즉, 호기적인 배양조건에서는 Fe-SOD가, 혐기적인 배양조건에서는 Mn을 함유한 SOD가 생성된다는 것을 확인할 수 있으며, catalase는 hydroperoxidase의 형태임을 추측할 수 있다. 금속이온의 재구성 실험에 의해 두 배양조건에서 생성되는 SOD는 Fe^(2+)와 Mn^(2+)를 환경에 따라서 선택적으로 각각을 보결원자로 사용할 수 있을 것으로 추측된다.

바로가기