Natural products are invaluable sources of biologically active secondary metabolites for drugs and functional foods development. The immunoaffinity of protein with ligand is broadly involved in many bioanalytical methods. In this chapter, six affinity-based high-performance liquid chromatography screening approaches including ultrafiltraion (UF)-unbound compounds fraction analysis (UFA), UF-bound ligands fraction analysis (BFA), microdialysis (MD)-UFA, MD-BFA, fishing using magnetic beads (MB)-UFA, and MB-BFA were developed, and their efficiency for identification of yeast α-glucosidase inhibitors from Perilla frutescens were compared. Results showed that UF is the technique used shortest time and had highest recovery percentage. Moreover, UF-UFA can identify both low and high affinity inhibitors without false results; however, UF-BFA can only identify high affinity inhibitors without false results. Nevertheless, MD and MB need more performance time, and false positive results were also appeared. These results suggested that UF- UFA is the best approach compared to other five approaches.
이 연구에서 친화도 기반 한외여과-고속액체크로마토그래피를 사용하여, 천연 제품 추출물로부터 다중 표적 시스템에서 특정 리간드를 직접 확인하기 위한 새로운 in vitro 분석법이 개발되었다. 이론의 증명으로서 약초 (천연추출물)의 상호 작용 사례 연구가 수행되었으며, 인간 (Salvia 간의 마이크로솜 (HLM)은 시토크롬 P450 (CYP450)의 소스로 사용되었고, 단삼 miltiorrhiza)는 새로운 방법을 유효하게 하기 위하여 선택되었다. 단삼 추출물을 HLM없이 또는 HLM과 함께 또는 예상되는 표적 효소의 활성 부위가 특이적 경쟁 검출에 의해 차단된 HLM과 함께 인큐베이션 한 후, 예상되는 표적 효소는 비 결합 화합물로부터 리간드-효소 복합체를 분리하기 위해 한외여과가 수행되기 전에 특정 효소에 의해 차단된다. 이어서, 단삼 50% 메탄올을 첨가하여 복합체로부터 리간드를 유리시키고, α-naphthoflavone, ketoconazole 및 sulfaphenazole은 각각 CYP1A2, 3A4 및 2C9의 특이적 경쟁 검출화합물로 사용되었다. 방출된 리간드에 대해 HPLC 분석을 수행 하여 얻어진 피크 면적에 따라 각 화합물의 신호 대 잡음비 (S / N)와 특정 신호 대 잡음비 (S-S / N)를 계산하였다. 또한, 마지막으로, 1) S/N > 1; 2) S-S/N > 0 두 개의 기준을 적용하여 각각의 특정 표적의 추정 리간드를 선택하였다. 위의 언급된 방법으로, dihydrotanshinone은 CYP1A2의 특이적 리간드로, tanshinone I, cryptotanshino 및 tanshinone IIA는 CYP1A2, 2C9 및 3A4의 특이적 리간드로 확인되었으며, 이 결과는 참고 문헌 및 컴퓨터 도킹 시뮬레이션을 비교하여 검증되었다. 이로써 새로이 개발된 다중 표적시스템 분석법은 특정 리간드가 신속하고 직접적으로 확인될 수 있다는 장점을 입증하였다. 핵심어: 한외여과, HPLC, 다중 표적 시스템, 천연 추출물, 약초 상호 작용