[目的]构建溶血性曼氏杆菌截短型白细胞毒素(LktA)原核表达系统,表达融合蛋白并进行纯化和鉴定,为溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供物质基础.[方法]设计并合成特异性引物,PCR扩增羊溶血性曼氏杆菌lkta截短基因;用限制性内切酶EcoR I和Hind Ⅲ对PCR产物和pET-28b(+)载体进行双酶切,用T4DNA连接酶将溶血性曼氏杆菌lkta截短基因克隆到pET-28b(+)载体;使用IPTG诱导融合蛋白LktA的表达.通过Ni2+亲和层析纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行鉴定.用融合蛋白LktA免疫4月龄健康雌性新西兰大白兔制备多克隆抗体,4次免疫完成后进行抗体效价测定.[结果]测序结果表明,构建的表达载体中溶血性曼氏杆菌lkta基因序列正确;融合蛋白LktA的分子质量约为30 ku,在大肠杆菌中高效表达并以包涵体形式存在,在变性条件下纯化融合蛋白LktA电泳图显示条带单一,确定其纯度>90%;纯化的融合蛋白LktA可与His抗体进行特异性结合.将纯化的融合蛋白LktA免疫新西兰大白兔后成功制备出多克隆抗体,抗体效价达1:256 000以上.[结论]本研究成功构建了羊溶血性曼氏杆菌截短型LktA的原核表达载体并制备其多克隆抗体,为后期溶血性曼氏杆菌检测方法的建立提供试验材料.