目的 探索黄芪建中汤含药血清对异丙肾上腺素(ISO)诱导的3T3-L1 脂肪细胞脂解及棕色 化模型的抑制作用及与脑和肌肉芳烃受体核转录因子样蛋白-1( BMAL1) 调控环磷酸腺苷 (cAMP) / 蛋白激酶A(PKA) / 环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(CREB) 信号通路的关系。方法 制 备空白及黄芪建中汤含药血清。体外培养3T3-L1 脂肪细胞,诱导其分化成熟后分为对照组、空白 组、2. 5%含药血清组、5%含药血清组、10%含药血清组。除对照组外,其余各组加入10 mmol/ L ISO 以构建脂肪细胞过度脂解及棕色化模型。采用油红O 染色法和酶联免疫吸附剂测定(ELISA) 法检测各组脂肪细胞内脂滴阳性面积比及其水解后产物的含量,采用实时荧光PCR 法和蛋白质印 迹法检测各组脂肪细胞脂解及棕色化相关基因及蛋白的表达,以筛选出最优体积分数的含药血清 进行下一步慢病毒转染实验。取分化成熟的3T3-L1 脂肪细胞,分别加入BMAL1 小干扰RNA、空 载体小干扰RNA,构建沉默BMAL1 的3T3-L1 脂肪细胞。将细胞分为空载体组、含药血清空载体 组、BMAL1 沉默组和含药血清BMAL1 沉默组。各组加入ISO 孵育后,油红 O 染色法检测各组脂肪 细胞内脂滴阳性面积比;ELISA 法检测各组脂肪细胞内甘油三酯(TG)、cAMP 及培养基中游离脂肪 酸(FFA)的含量;蛋白质印迹法检测PKA、CREB 的蛋白表达;实时荧光PCR 法检测激素敏感性脂 肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、线粒体解偶联蛋白1(UCP1)和T-box 转录因子1(TBX1)的 mRNA 表达。结果 与2. 5%及5%含药血清组比较,10%含药血清组细胞内cAMP 含量及培养基 中FFA 含量降低( 均P <0. 05)、TG 含量升高( P <0. 05)、PKA 蛋白表达降低( P <0. 05)、HSL 及 ATGL mRNA 表达降低(均P<0. 05)。慢病毒转染3T3-L1 脂肪细胞后,与空载体组比较,BMAL1 沉 默组中BMAL1 蛋白表达降低(P<0. 05),表明BMAL1 沉默的脂肪细胞成功构建。与空载体组比 较,BMAL1 沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG 含量降低(均P<0. 05),培养基中FFA 含量、细胞 内cAMP 含量和PKA、CREB 蛋白表达升高(均P<0. 05),HSL、ATGL、UCP1 和TBX1 mRNA 表达量 升高(均P<0. 05)。与BMAL1 沉默组比较,含药血清BMAL1 沉默组细胞内脂滴阳性面积比及TG 含量升高(均P<0. 05),培养基中FFA 含量、细胞内cAMP 含量、PKA 和CREB 蛋白表达降低(均P <0. 05),HSL、ATGL、UCP1 及TBX1 的mRNA 表达降低(均P<0. 05)。结论 黄芪建中汤含药血清 可以抑制ISO 诱导的3T3-L1 脂肪细胞脂解及棕色化,其机制可能通过介导BMAL1 调控cAMP / PKA/ CREB 信号通路有关。 [ABSTRACT FROM AUTHOR]