Proteins bind to other molecules such as proteins and nucleotides and participate in life phenomena. It is very crucial to understand the molecular interactions in the cell to identify the cause of the disease and to treat it. Here I focus on Rev-RRE (Rev response element) interaction which is related to Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Rev protein mediates cytoplasmic export of not fully spliced RNA and that is main factor of viral replication. This interaction is mediated by specific binding of helical small peptide (Arginine Rich Motif: ARM) to the RRE RNA, so the helical structure of the ARM peptide is important in efficient binding with the target RRE RNA molecule. Alpha-helix, when isolated from the protein as a peptide, is rarely helical and conformationally heterogeneous due to its intrinsic thermodynamic instability. Since the stabilization of peptide’s active conformation is a critical determinant of its target binding efficiency, this study presents the development of helix stabilizing strategies to overcome the intrinsic instability of small α-helical peptide. First, I present a structure-based self-assembly strategy for the design of nanostructures with multiple and thermostable α-helices using bioinspired peptide amphiphiles. The design principle was inspired by the oligomerization of the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) Rev protein. To modify the Rev protein into a chemically manageable self-assembling peptide while stabilizing its α-helical structure, this strategy utilizes the pseudo-cyclization for helix stabilization instead of using cyclic peptides for structure stabilization. The self-assembly induced stabilization of α-helical conformation could be observed, and the α-helices were found to be stable even at high temperature (at least up to 74 °C). Conjugation of a hydrophobic alkyl chain to the Rev peptide was crucial for forming the self-assembled nanostructures, and no nanostructures could be obtained without this modification. Because chemical modifications to the α-helical peptide domain can be avoided, potentially any α-helical peptide fragment can be grafted into this self-assembling peptide scaffold.Next, I report on a ratiometric fluorescence biosensor based on self-assembled peptide nanostructures (SPN), which can respond to conformational changes induced by RNA ligand binding. The design of the SPN biosensor was inspired by the conformational stabilization and multimerization behaviors of the HIV-1 Rev protein induced by cooperative protein−protein and protein−RNA interactions. Because conformation-sensitive SPN biosensors can orchestrate binding and signal transduction events, they can be developed as highly sophisticated and smart nanomaterials for biosensing.And I also introduce helix stabilizing with coiled coil scaffold. In this design, pseudo-cyclization effect, the effect of fixing both ends of protein with intramolecular interaction, restricted the movement of the molecules, then contributing to the stabilization of the α-helix. Unlike the aggregation properties of natural Rev proteins, designed proteins were present as monomers, maintaining the hairpin shape of the rev peptide, and evenly distributed without aggregation in the solution. Its secondary structure was consisted of almost 85% of the α-helix, and it has a reversible folding characteristic even with temperature change. In addition, binding affinity could increase in comparison with free peptide according to structural stability. This dissertation provides novel strategies to stabilize α-helix by pseudo-cyclization effect. With applying self-assembly and novel protein design, the Rev ARM α-helical domain was efficiently stabilized and it showed functions as a sensor and potential inhibitor. Ultimately, this helix stabilization strategies can have a positive effect on the treatment and diagnosis of AIDS and can be combined with more general helix stabilization technology.
단백질은 단백질이나 뉴클레오타이드와 같은 다른 분자에 결합하고 생명 현상에 참여한다. 세포의 분자 상호 작용을 이해하여 질병의 원인을 규명하고 치료하는 것이 매우 중요하다. 본 연구에서는 후천성면역결핍증 (에이즈) 과 관련된 Rev-RRE (Rev 반응 요소)의 상호 작용에 중점을 둔다. Rev 단백질은 완전히 접합(splicing) 되지 않은 RNA의 핵에서의 세포질 내 전달을 매개하는데 이는 바이러스 복제와 관련이 있다. 이러한 상호 작용은 알파-나선 구조의 작은 펩타이드인 아르기닌 풍부 모티프(Arginine Rich Motif: ARM)가 RRE RNA에 특이 적으로 결합하여 이루어 지므로 ARM 펩타이드의 나선형 구조가 표적 RRE RNA 분자와의 효율적인 결합에 중요하다.단백질로부터 펩타이드로 분리된 알파-나선은 본질적으로 열역학적인 불안정성 때문에 거의 구조가 나선형태를 이루지 못하고 풀어지게 된다. 펩타이드의 활성 구조의 안정화가 표적 결합 효율의 중요한 결정 인자이기 때문에 이 연구에서는 작은 알파-나선 펩타이드의 본질적인 불안정성을 극복하기 위한 헬릭스 안정화 전략의 개발을 제시한다.먼저, 생물체에서 기반한 펩타이드 양친매성 물질을 사용하여 다중 및 열 안정성 알파-나선 구조를 갖는 나노 구조물 디자인을 위한 구조 기반 자기 조립 전략을 제시한다. 디자인 원리는 인간 면역 결핍 바이러스 유형-1 (HIV-1) Rev 단백질의 중합체화에 의해 영감을 받았다. Rev 단백질을 화학적으로 조절 가능한 자기 조립 펩타이드로 변형시키면서 알파-나선 구조를 안정화시키기 위해, 구조 안정화를 위해 고리 형 펩타이드를 사용하는 대신 나선형 안정화를 위해 유사-고리화(pseudo-cyclization)를 이용한다. 자가조립에 의한 알파-나선 구조의 안정화를 유도되었으며, 알파-나선은 고온 (74 ℃까지) 에서도 안정한 물성이 발견되었다. Rev 펩타이드에 소수성 알킬 사슬의 접합은 자기 조립된 나노 구조물을 형성하는 데 결정적이었다. 알파-나선 펩타이드 도메인에 대한 화학적 변형이 피할 수 있기 때문에, 잠재적으로 모든 알파-나선 펩타이드를 이 자기 조립 펩타이드 틀에 적용할 수 있다.다음으로, RNA 리간드 결합으로 인한 구조적 변화에 반응할 수 있는 자기 조립 펩타이드 나노 구조 (SPN)를 기반으로 한 형광 바이오 센서를 제안한다. SPN 바이오 센서의 디자인은 단백질간의 중합체화 및 단백질 과 RNA의 상호 작용에 의해 유도된 HIV-1 Rev 단백질의 구조 안정화 및 다가성(multivalent) 행동에 영감을 받았다. 구조적으로 민감한 SPN 바이오 센서는 바인딩에 의해 신호의 변화를 전달할 수 있기 때문에 바이오 센싱을 위한 매우 정교하고 스마트한 나노 물질로 개발될 수 있다.마지막으로, 알파-나선 다발(coiled coil)의 틀로 알파-나선 구조의 안정화를 도입한다. 이 디자인에서 유사-고리 화 효과는 단백질의 양 말단을 분자 내 상호 작용으로 고정시키는 효과로, 분자의 움직임을 제한하고 알파-나선의 안정화에 기여한다. 천연 Rev 단백질의 응집 특성과는 달리, 이들은 Rev 펩타이드의 헤어핀 형태를 유지하면서 단량체로서 존재하였고, 응집 없이 용액에 고르게 분포하였다. 2 차 구조는 약 85 %의 나선형 구조를 가지며, 온도 변화에도 가역적인 접힘 특성을 갖는다. 또한, 알파나선 다발을 틀로 하여 디자인된 단백질은 구조적 안정성에 따라 짧은 ARM 펩타이드에 비해 결합 친화력이 증가할 수 있다.이 논문은 유사-고리화 효과에 의해 알파-나선구조를 안정화 시키는 새로운 전략을 제공한다. 자기 조립 및 새로운 단백질 디자인을 적용하여, Rev ARM 알파-나선 도메인을 효율적으로 안정화하였으며 센서 및 잠재적인 억제제로서의 기능을 보였다. 궁극적으로 이 헬릭스 안정화 전략은 에이즈의 치료 및 진단에 긍정적 인 영향을 줄 수 있으며 보다 일반적인 헬릭스 안정화 기술과 결합될 수 있다.