기존의 진단에서는 일반적으로 환자에게 여러 번의 혈액 채취, 많은 병원 방문, 시약 용량 증가 및 진단 시간 증가와 같은 수많은 검사를 요구한다. 이러한 문제를 피하기 위해 소량의 시료를 사용하여 여러 바이오 마커를 동시에 분석 가능한 마이크로 어레이 분석 기술(Microarray analysis technology, MAT)이 도입되었다.MAT의 주요 이점은 많은 실험 대신 단일 실험을 수행하여 빠르고 쉬운 방법으로 수천 개의 데이터 결과를 얻을 수 있다는 점이다. 현재 형광 마이크로 어레이 분석 기술이 형광 라벨을 사용하는 검출 방법에 널리 사용되지만 높은 처리 비용과 낮은 감도로 인해 적용이 제한된다. 간단한 탐지 메커니즘과 함께 저가의 간단한 제조 공정으로 이러한 플랫폼의 감도를 향상시키기 위한 많은 연구가 수행되었다. 이들 기술 중에서, 넓은 표면적에 걸쳐 저비용 제조 공정으로 마이크로/나노 계층 구조를 구현함으로써 표면에서 효과적인 형광 증폭이 이루어지는 본 연구의 강화 형광 시스템은 성능을 향상시키기 위한 손 꼽히는 후보로 간주된다.본 논문의 목적은 체액 단백질의 정량 분석을 위해 고감도, 단순한 공정, 높은 균일도, 저비용, 대면적, 대량 생산등의 장점이 있는 마이크로/나노 계층구조 강화 형광 마이크로 어레이 바이오 칩을 개발하는 것이다. 목적을 달성하기 위해, 마이크로/나노 MEF 마이크로 어레이 바이오 칩은 자외선(UV) 마이크로/나노 임 프린팅 공정 및 물리적 금속 증착 법에 의해 제조되었고, 다수의 바이오 마커 동시 검출, 다수의 바이오 마커를 이용한 단백질 정량화에 의해 평가되었다. 또한 정규화 된 LSPR 파장 피크의 이동 데이터를 사용하여 항체의 초기 량을 계산하고 보정하여 분산 계수 (%CV)를 감소시켜 더 높은 신뢰성을 확보할 수 있었다.논문의 첫 번째 부분으로, 3차원(3D) 플라즈몬 나노 안테나 닷(Plasmonic Nano-Antenna Dots, PNAD)을 포함하는 단순하고 비용 효율적이며 넓은 표면적의 기판을 제조하는 제조 방법을 시연했다. PNAD 나노 구조는 75x25 mm² 크기의 통상적인 유리 기판 위에 성공적으로 제조되었다. PNAD 어레이에 증착 된 최적 금속 길이를 찾기 위한 실험을 진행하였으며, 성능은 형광 물질(streptavidinCy5, SA-Cy5)의 증폭 특성을 비교함으로써 최적화하였다. MEF 성능은 종래의 유리와 비교하여 모든 제조된 나노 구조에서 달성되었으며, PNAD에서 Ag 증착 길이75nm에서 440x의 최대 형광 향상 인자(Fluorescence enhancement factor, FEF)가 달성되었다. 최대 FEF를 얻은 후, 최적화된 PNAD-MEF를 이용하여 동시에 다수의 바이오 마커를 정량 함으로서 다중 생체 검출 플랫폼으로 평가하였다. 마지막으로, 임상적 타당성은 PNAD-MEF 및 ELISA 키트를 이용하여 환자 샘플의 정량 분석결과를 비교하여 입증되었다. 논문의 두 번째 부분으로서, 마이크로/나노 계층 구조 어레이 기판을 마이크로/나노 임 프린팅 및 금속 증착 방법을 사용하여 제조되었다. 개발된 고 민감 마이크로/나노 MEF 기판을 사용하여 PNAD-MEF 기판에 비해 신호 대 잡음 비(Signal to Noise ratio, SNR)가 10배 향상되었다. 또한 분주한 항체 spot의 매우 균일하고 규칙적인 크기를 제공하여 spot의 크기가 개선되었으며, %CV 비교 결과 13.7%에서 10.42%로 감소되는 결과를 보였다.논문의 세 번째 부분으로서, 개발된 마이크로/나노 기판을 MEF 분석 기법과 더불어LSPR 분석 기법을 활용하여 그 신뢰성을 향상시켰다. LSPR분석 기법을 위해 LSPR의 피크를 얻을 수 있도록 광학 셋업 설계 및 계측을 진행하였다. LSPR과 MEF 간에 좋은 관계성이 발견되었다. 동일한 시료를 가지고 MEF에서 더 큰 형광 강도를 제공하는 spot의 경우LSPR에서 더 큰 피크 이동을 확인할 수 있었다. 이는 마이크로/나노 계층 MEF 표면에 더 많은 수의 분자가 부착됨을 의미하며 항원 결합은 항체의 초기량에 직접적으로 의존한다는 것을 알 수 있다. 마지막으로, MEF 형광 강도는 정규화 방법을 사용하여 LSPR에 의해 보정되었으며, 그 결과 분산 계수(CV)가 급격히 감소되는 결과를 보였다. (~60%)
Within traditional diagnosis several tests are typically required which involves multiple blood draws from the patient, many visits to the hospital, increased reagent volume and increased time to diagnosis. To avoid such problems, microarray analysis technology (MAT) is introduced which is a key technology that can analyze multiple biomarkers simultaneously using a small amount of samples to implement point-of-care in the future. The dominant benefits of MAT are; it provides the data for thousands, single experiment instead of many, and fast and easy method to obtain the results. Current fluorescent microarray analysis techniques are widely used in detection methods using fluorescent labels but their low sensitivity, poor limit of detection as well as high cost restricted their applications. A number of investigations were performed for increasing the sensitivity of such platforms at a very simple and cost effective fabrication method along with a simple mechanism of detection. Among these techniques, polymer replicated micro/nano hierarchy structures incorporated on various substrates with low-cost fabrication process over large surface area regarded as amazing candidate for enhancing the performances of such systems. The aim of this dissertation is to develop highly sensitive, simple, uniform, low cost, large-area, mass production concept, enhanced fluorescence microarray biochip for quantitative analysis of proteins in the body fluid using polymer replicated micro/nano hierarchy structures. To achieve the objectives, polymer replicated micro/nano hierarchy MEF microarray biochip was fabricated by Ultra-violet (UV) micro/nano imprinting and Physical vapor deposition methods and was evaluated for simultaneous detection of multiple biomarkers of atopic dermatitis disease, quantification of multiple biomarkers, as well as reduce the coefficient of variance (%CV) to calculate the initial amount of antibody using normalized data of LSPR wavelength peaks shift.As the 1st part of the dissertation, we have demonstrated the fabrication method for fabricating the simple, cost effective, and large surface area platform, which contains the three dimensional (3D) plasmonic nano-antenna dots (PNAD) array. The PNAD nanostructures have been successfully fabricated over a conventional glass substrate (75 × 25 mm2) with various morphologies. Initially, the morphologies were optimized using metal deposition on PNDA array and their performance was characterized as MEF biosensor by spotting the multiple spots of streptavidin Cy5 (SA-Cy5). Enhanced performance of MEF substrate was achieved on all fabricated PNAD nanostructures compared to the conventional glass, and a maximum fluorescence enhancement factor (FEF) of 440× was achieved at the Ag deposition of 75 nm on PNAD array. After getting maximum FEF, the optimized PNAD-MEF substrate was further evaluated as a multiplex bio-detection platform by spotting the multiple biomarkers simultaneously of atopic dermatitis disease. Furthermore, the linearity analysis was investigated on PNDA-MEF substrate and was compared with the commercialized ELISA kits. Finally, the clinical feasibility was demonstrated by quantification analysis of the stated biomarkers in human patient’s samples on PNAD-MEF substrate as well as commercialized ELISA kits. A great agreement was found between PNAD-MEF substrate and commercialized ELISA kits. As a 2nd part of the dissertation, the polymer replicated micro/nano hierarchy structural array platform was fabricated using micro/nano imprinting and metal deposition methods. This novel micro/nano hierarchical platform was evaluated as MEF microarray biochip. Using the developed micro/nano hierarchical-MEF substrate, 10 times SNR was improved as compared to the PNAD-MEF substrate. In addition, the size of the spots was also improved by providing very uniform and regular size of the captured antibody spots and %CV was also reduced from 13.7% to 10.42%. As a 3rd part of the dissertation, micro/nano hierarchical platform was evaluated as MEF as well as LSPR microarray biochip. For the LSPR purpose, an optical setup was designed and instrumented to get the LSPR sharp peaks. A good agreement was found between LSPR and MEF; MEF gives the larger fluorescence intensity whereas the LSPR gives the larger peak shift for the same spots, which means more number of molecules attached on the micro/nano hierarchical-MEF surface and the antigen binding directly depends on the initial amount of antibody. Finally, MEF fluorescence intensities was compensated by LSPR using the normalization method as a result the co-efficient of variance (CV) was dramatically reduced (~ 60%)