In the past, generally classical 2-dimensional (2D) cell cultures or immunodeficient animal models had been used to cultivate and test drugs on human cancer cell lines. Nowadays, there are increasing interests in 3-dimensional (3D) cell cultures, a method with significant differences from flat cultured cells, both considering gene expressions and cell-to-cell interactions. A micropillar/microwell chip platform was applied to develop a 3D cell-based high content screening (HCS) platform. Previously, 3D cell culture in the micropillar/microwell chip platform was only limited to cell viability measurements in a high-throughput manner. However, an HCS system could provide biological and phenotypic information which was very useful to understand complex biological functions and mechanisms of drug actions. To stain 3D cultured cells immobilized with alginate spots, we developed and optimized antibody staining procedures for 3D cultured cells. As a proof of concept, the phospho-EGFR (p-EGFR), F-actin, and nuclei of 3D cultured cells were stained and analyzed after being treated with 72 different drugs. The p-EGFR inhibition of the drugs was successfully identified in the 3D cultured cells by comparing p-EGFR expression with that of F-actin and the nucleus. The p-EGFR expression levels were measured by western blot to verify the chip data. A common method of 3D cell cultures is embedding single cells in Matrigel. Separated cells in Matrigel migrate or grow to form spheroids but lack cell-to-cell interaction, which causes difficulty or delay in forming mature spheroids. To address this drawback, we proposed a 3D aggregated spheroid model (ASM) to create large single spheroids by aggregating cells onto the surface of 96-pillar plates. In a drug screening assay, the ASM with Hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines showed higher drug resistance compared to both a conventional spheroid model (CSM) and a 2D cell culture model. The ASM showed higher expression of cancer markers associated with proliferation, tight junction formation, and epithelial cell identity in HCC cells. Furthermore, cytokine factors were increased, which were associated with the tumor microenvironment (TME). Compared to CSM, the ASM also showed limited drug penetration in doxorubicin (DOX). Thus, the proposed ASM better recapitulated the TME and can provide for more instructive data during in vitro drug screening assays of tumor cells and improved prediction of efficacious drugs in HCC patients.
과거에는 일반적으로 2차원 세포 배양법 또는 면역결핍 동물 모델을 활용하여 인간 암세포주 배양 및 약물 효능 분석을 수행했다. 하지만 최근에는 유전자 발현과 세포 간 상호작용을 고려하여 2차원으로 배양된 세포와 큰 차이를 보이는 3차원 세포 배양법에 대한 관심이 증가하고 있다. 본 연구에서는 3차원 세포 배양법을 마이크로필러/마이크로웰 칩에 적용하여 이미지 기반 고효율 스크리닝 (HCS) 플랫폼을 개발했다. 이전에는 마이크로필러/마이크로웰 칩에서 3차원으로 배양된 세포에 대한 초고속 대용량 스크리닝 (HTS) 분석만 제한적으로 수행되었다. 그러나 이미지 기반 고효율 스크리닝 (HCS) 시스템은 복잡한 생물학적 기능과 약물 작용의 메커니즘을 이해하는데 매우 유용한 생물학적 표현형 정보를 제공할 수 있는 장점이 있다. HCS를 위해 3차원 배양 세포에 대한 면역 형광 염색법을 개발하고 최적화했다. 개발된 마이크로필러/마이크로웰 칩 플랫폼의 성능, 개념을 증명하기 위해 72 종의 항암체를 3차원 배양 세포에 처리하였고, phospho-EGFR(p-EGFR), F-actin 및 세포핵에 대한 염색 및 발현량을 정량 분석했다. 그 결과 약물에 의한 p-EGFR 억제, 세포활성도 감소를 확인하였다. 추가로 이미지 기반의 칩 데이터를 검증하기 위해 웨스턴 블롯을 통한 단백질 발현량 분석을 통해 p-EGFR 발현 수준을 측정하였다. 또한 일반적으로 3차원 세포 배양을 위해 세포외기질인 Matrigel과 세포를 혼합하여 분주한다. Matrigel에서 분리된 세포는 성장하여 스페로이드 구조를 형성하는데 부족한 세포 간 상호 작용으로 인해 보다 성숙, 배양된 3차원 스페로이드 구조를 형성하기 어려운 문제가 있다. 본 연구에서는 이러한 문제를 해결하기 위해 96-필라 어레이 플레이트 표면에 세포를 분주, 집적하여 단일 스페로이드 구조를 형성하는 3차원 집계 스페로이드 모델(ASM)을 고안했다. 약물 스크리닝 분석에서 ASM 형태로 배양된 간세포성 암종 (HCC) 세포주는 일반적인 3차원 스페로이드 모델(CSM) 및 2차원 세포 배양 모델에 비해 더 높은 약물 저항성을 보였다. HCC 세포는 ASM에서 세포 증식, 밀착 연접 형성 및 상피 세포 특성과 관련된 종양 인자가 더 높게 발현되었고, 종양 미세 환경(TME)과 관련된 사이토카인 인자가 증가했다. CSM과 비교하여 ASM은 제한된 약물 투과도를 보였다. 따라서 제안된 ASM은 HCC 세포주의 TME를 더 잘 반영할 뿐만 아니라 3차원 세포 배양법 기반의 약물 스크리닝 분석을 통해 보다 정확한 약물 감수성 정보를 제공하고 HCC 환자에게 보다 효율적인 치료 약물 후보를 제공할 수 있다.