L-Citrulline is a neutral amino acid and a major precursor of L-arginine in the nitric oxide (NO) cycle. Recently it has been reported that L-citrulline prevents neuronal cell death and protects cerebrovascular injury. Therefore, L-citrulline may have a neuroprotective effect to improve cerebrovascular dysfunction. Therefore, we first aimed to clarify the brain transport mechanism of L-citrulline across the blood-brain barrier (BBB) using the conditionally immortalized rat brain capillary endothelial cell line (TR-BBB cells), as an in vitro model of the BBB. For this study, the uptake study of [14C]L-citrulline, quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) analysis, and rat large neutral amino acid transporter 1 (rLAT1), system b0,+, and cationic amino acid transport 1 (CAT1) small interfering RNA (siRNA) study were performed in TR-BBB cells. The uptake of [14C]L-citrulline showed a time-dependent, but an ion-independent manner in TR-BBB cells. The transport process is involved in two saturable components with a Michaelis-Menten constant of 30.9 ± 1.0 µM (Km1) and 1.69 ± 0.43 mM (Km2). The uptake of [14C]L-citrulline in TR-BBB cells was significantly inhibited by neutral and cationic amino acids, but not by anionic amino acids. In addition, [14C]L-citrulline uptake in the cells was markedly inhibited by 2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH), which is the inhibitor of LAT1, B0, B0,+ and harmaline, the inhibitor of system b0,+. Gabapentin and L-dopa as the substrates of LAT1 competitively inhibited the uptake of [14C]L-citrulline. The half inhibitory concentration (IC50) values for L-dopa, gabapentin, L-phenylalanine and L-arginine were 501 µM, 223 µM, 68.9 µM and 33.4 mM, respectively. The expression of mRNA for LAT1 was predominantly increased 187-fold in comparison with that of system b0,+ in TR-BBB cells. In the studies of LAT1, system b0,+ and CAT1 knockdown by siRNA transfection into TR-BBB cells, the transcript level of LAT1 and [14C]L-citrulline uptake by LAT1 siRNA transfection were significantly reduced compared with those by control siRNA in TR-BBB cells. Next, glutamate excitotoxicity leads to collapse of the BBB and induces neuronal cell damage and death. It has been already mentioned that L-citrulline can prevent both neuronal cell death and cerebrovascular cell loss in brain ischemia. Therefore, the second objective of this study was to investigate the effect of L-citrulline on glutamate cytotoxicity in the BBB using TR-BBB cell as an in vitro model of the BBB. Cell viability was determined using MTT assay. Cellular uptake of [14C]L-citrulline and expression levels of rLAT1, endothelial nitric oxide synthase (eNOS), and inducible nitric oxide synthase (iNOS) at mRNA level were performed using qPCR analysis. NO production from TR-BBB cells was measured using Griess reagents. All experiments were performed after treatment of TR-BBB cells with glutamate alone or co-treatment with L-citrulline, L-arginine, and/or taurine for 24h. L-Citrulline treatment increased cell viability, [14C]L-citrulline uptake, and the mRNA levels of LAT1 and eNOS in TR-BBB cells treated with glutamate alone. However, iNOS mRNA expression was inhibited by L-citrulline in TR-BBB cells treated with glutamate alone. NO production and transcript level of iNOS were markedly increased by glutamate treatment alone. However, co-treatment with L-citrulline, taurine, or both L-citrulline and taurine decreased NO levels and mRNA levels of iNOS in TR-BBB cells treated by glutamate. In co-treatment of TR-BBB cells with L-arginine, a NO donor, and glutamate, NO levels were increased and expression levels of iNOS mRNA were similar compared to those in cells treated with glutamate alone.In conclusions, our results suggest that transport of L-citrulline is mainly mediated by LAT1 in TR-BBB cells. L-Citrulline also can restore NO level and its cellular uptake in TR-BBB cells with glutamate cytotoxicity. Therefore, delivery strategy for LAT1-mediated transport and supply of L-citrulline to the brain may serve as therapeutic approaches to improve cerebrovascular protective effect in patients with cerebrovascular disease.
L-Citrulline은 중성 아미노산이며, nitric oxide (NO) cycle내에서 L-arginine의 주된 전구체이다. 최근, L-citrulline이 신경세포 사멸 (neuronal cell death)을 방지하고 뇌혈관 손상(cerebrovascular injury)을 보호한다는 연구가 보고되었다. 그러므로, L-citrulline이 뇌혈관 기능장애를 향상시키는 뇌혈관과 신경보호효과를 가지고 있을 것으로 예상된다. 따라서, 본 연구의 첫번째 목적은 혈액-뇌관문 (blood-brain barrier, BBB)의 in vitro 모델인 조건적 불사화 흰쥐 뇌혈관 내피세포주 (conditionally immortalized rat brain capillary endothelial cell line)인 TR-BBB 세포주를 이용하여, 혈액-뇌관문을 통한 L-citrulline의 수송메카니즘을 규명하는 것이었다. 본 연구에서 TR-BBB 세포내에서 방사성 동위원소를 이용한 [14C]L-citrulline 투과성 연구, 정량적 real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) 연구, 그리고 rat large neutral amino acid transporter 1 (rLAT1), system b0,+과 cationic amino acid transport 1 (CAT1) small interfering RNA transfection 연구가 수행되었다. TR-BBB 세포 내로의 [14C]L-citrulline 투과는 시간 의존적이지만, 이온에 대한 비의존적인 양상을 보였다. L-Citrulline의 수송 과정은 Michaelis–Menten 상수인 Km 수치가 각각 30.9 ± 1.0 µM (Km1)과 1.69 ± 0.43 mM (Km2)로 나타나는 two saturable component가 관여하는 것으로 확인되었다. 또한, [14C]L-citrulline 투과는 중성과 양성 아미노산들에 대해서는 유의적인 저해 효과가 나타나는 반면, 음성 아미노산들에 대해서는 저해 효과가 나타나지 않았다. LAT1, system B0과 system B0,+의 저해제인 2-aminobicyclo -(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH)과 system b0,+의 저해제인 harmaline에 의해서 [14C]L-citrulline 투과는 현저하게 저해되었다. LAT1의 기질 약물인 gabapentin과 L-dopa는 [14C]L-citrulline 투과와 경쟁적인 저해 효과를 보였다. L-Dopa, gabapentin, L-phenylalanine, L-arginine의 IC50값은 각각 501 µM, 223 µM, 68.9 µM, 33.4 mM였다. 한편, LAT1에 대한 mRNA의 발현은 TR-BBB 세포 내에서 system b0,+의 mRNA에 비해 187배로 현저하게 높게 나타났다. TR-BBB 세포로의 siRNA transfection을 통한 LAT1, system b0,+, CAT1의 knockdown 실험에서는 LAT1 siRNA에 의한 LAT1 전사수준과 [14C] L-citrullin의 투과가 control siRNA에 의한 이들 투과에 비해 유의적으로 감소함을 보였다. 다음으로, glutamate 세포독성은 뇌허혈(brain ischemia)로 인하여 발생하는 현상 중 하나로, glutamate 세포독성에 의하여 BBB의 파괴가 유도되고, 이에 의해 신경세포 손상을 유발한다. 앞서 언급한 바와 같이, L-citrulline이 뇌허혈상태에서 신경세포 사멸과 뇌혈관세포 손실을 방지하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 TR-BBB 세포를 이용하여, 뇌혈관 내피세포의 glutamate 세포독성 상태에서 L-citrulline의 보호효과에 대하여 검토하였다. 두번째 연구에서는 TR-BBB세포에 glutamate 단독처리 또는 glutamate와 함께 L-citrulline, L-arginine, taurine 또는 L-citrulline과 taurine을 동시에 24시간 동안 처리한 후, MTT assay를 통한 세포활성도 (cell viability)를 확인하였으며, 방사성 동위원소를 이용한 [14C]L-citrulline 투과성 연구, rLAT1, endothelial nitric oxide synthase (eNOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 mRNA 발현정도를 알기 위해 정량적 RT-PCR분석이 시행되었다. NO 생성은 Griess reagent system을 이용하여 측정하였다. L-Citrulline은 glutamate을 단독처리한 TR-BBB 세포주에 비해 세포활성도, [14C]L-citrulline 투과, LAT1, eNOS mRNA 발현을 유의적으로 증가시켰으나, iNOS mRNA 발현은 감소시키는 것을 알 수 있었다. NO 생성과 iNOS의 발현정도는 glutamate 단독처리한 TR-BBB 세포주에서의 발현에 비해 현저히 증가하였다. 그러나, L-citrulline, taurine, 또는 L-citrulline과 taurine을 동시에 glutamate와 처리하였을 때는 NO 생성과 iNOS 발현정도는 glutamate 단독처리에 비해 유의적으로 감소함을 보였다. 대조적으로, NO donor인 L-arginine을 glutamate와 함께 처리하였을 때에는 NO 생성과 iNOS mRNA발현이 glutamate 단독처리에 비해 증가함을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구를 통해 TR-BBB 세포주에서 L-citrulline의 수송은 주로 LAT1에 의해 매개되고 있으며, glutamate 세포독성 상태에서 NO 생성을 정상상태로 회복시키고, L-citrulline의 투과 역시 정상상태와 유사한 수준으로 회복시켰다. 따라서, L-citrulline의 LAT1을 매개로 한 뇌로의 수송과 그의 공급은 뇌 허혈과 같은 뇌혈관 질환을 가진 환자들에 있어서 뇌혈관 보호 효과를 향상시키는 치료적 전략법으로 모색할 가능성을 시사하였다.