T 세포 또는 암 세포 표면에서 음성 조절자로 발현되는 면역 검문소 단백질은 면역계에서 T 세포의 세포 독성 기능을 불활성화 한다. 예를 들어, CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4), PD-1 (Programmed cell death-1) 및 PD-L1 (Programmed death-ligand 1)은 면역관문 단백질로서 잘 알려져 있다. 이러한 T 세포 불 활성화 신호는 암 면역 요법에서 암을 죽이는 면역관문 억제제를 통해 억제되어야 한다. 그러므로, 이들은 여러 종류의 암에서의 잠재력으로 인해 암 면역 요법의 새로운 표적으로 연구되고 있다.재조합 DNA 기술로 만들어진 면역관문 억제제는 많은 임상 시험에서 암 면역 요법을 위한 치료용 항체 의약품으로 사용되었으며, 이들 중 거의 대부분이 포유류 세포에서 생산된다. 그러나 포유류 세포 발현 시스템은 생산 비용이 높고, 인체 병원균의 잠재적인 오염 및 제한된 확장성 이라는 몇 가지 단점을 가지고 있는 반면, 식물 발현 시스템은 쉬운 대량생산 능력 및 동물 병원균 오염의 가능성이 적다는 것, 바이오 매스 생산 비용이 낮다는 등의 특징을 가진다. 따라서 식물체 발현 시스템을 이용한 면역관문 억제제 생산은 암 면역요법에 적용할 수 있는 유망한 접근법이 될 수 있다.본 연구는 면역관문 억제제를 식물 발현 시스템에서 발현하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 식물 유래 면역관문 억제제를 발현하는 식물 발현 벡터를 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축하고, Agrobacterium 매개 형질 전환 방법에 의해 만들어진 in-vitro 형질 전환 담배 식물을 이용하여 PCR 및 Western blot으로 유전자 삽입 및 단백질 발현 수준을 조사하였다. 또한, 대량으로 수확된 in-vivo 형질전환 담배 잎에서 일련의 과정을 거쳐 정제하였다. 그 후, 각 항원과의 결합 친화성을 분석하기 위해 ELISA를 사용하여 정제된 단백질을 포유류 세포 유래 면역관문 억제제와 비교하였다.이러한 결과들을 토대로, 면역관문 억제제는 포유류에 기초한 발현 시스템뿐만 아니라 식물 기반의 발현 시스템에서도 생산될 수 있다는 결론이 나왔다. 그리고 형질 전환 식물에서 생산된 식물 유래 면역관문 억제제의 항원 결합 친화력은 포유류 세포 유래 면역관문 억제제와 유사함을 나타내었다.
Immune checkpoint proteins expressed on T cell or cancer cell surfaces as negative regulators inactivate the cytotoxicity function of T cells in the immune system. For example, CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4), PD-1 (programmed cell death-1) and PD-L1 (programmed death-ligand 1) are well known to researchers. These T cell inactivation signals should be suppressed through immune checkpoint inhibitors for the killing of cancers in cancer immunotherapy. Due to their potential in multiple types of cancers, they have been studied as new targets for cancer immunotherapy. Immune checkpoint inhibitors (ICIs) made by recombinant DNA technology have been used as therapeutic monoclonal antibodies for cancer immunotherapy in many clinical trials, and most of them have been produced in mammalian cells. However, the mammalian cell expression system has several disadvantages, namely high production costs, potential contamination of human pathogens and limited scalability, while the plant expression system offers large-scale capacity for production, lack of animal pathogen contamination, a low cost of biomass production. Therefore, a plant expression system to produce ICIs is a promising approach for cancer immunotherapy. The main purpose of this research is to express the immune checkpoint inhibitors (ICIs) in a plant expression system. In this study, the plant expression vectors for ICIs (anti-CTLA-4, anti-PD-1 and anti-PD-L1 mAbs) were constructed for Agrobacterium-mediated plant transformation to generate transgenic tobacco. The transgene insertion and protein expression were investigated in transgenic tobacco plant. After mass production, plant-derived ICIs were purified from harvested leaves, and were analyzed for binding affinity with antigens, CTLA-4, PD-1 and PD-L1. Taken together, in-vitro and in-vivo transgenic tobacco plants carrying plant-derived ICIs could be generated in large quantities, and the binding affinity of plant-derived ICIs was similar to mammalian-derived ICIs. In conclusion, ICIs can be expressed in a plant expression system as well as a mammalian cell expression system.