A aplicação de lipases em vários campos tem aumentado notavelmente nas últimas décadas e melhorias qualitativas/quantitativas precisam ser feitas. Entretanto, a fim de encontrar um bom produtor de lipase muitas metodologias de seleção são descritas, além disso, a otimização estatística é uma ferramenta necessária para melhorar a produção de lipases. Este trabalho apresenta o isolamento de fungos filamentosos produtores de lipase e a avaliação da capacidade de transesterificação dessas enzimas. Quatro fungos foram selecionados para os ensaios de transesterificação e o melhor fungo isolado foi submetido a fermentação submersa. Parâmetros do meio de cultivo foram otimizados usando metodologia de superfície de resposta. O meio de cultivo líquido selecionado foi o SR, a 30 °C, 72 h e 100 rpm. Óleo de milho foi a melhor fonte de carbono e, quando adicionado de Tween 80 aumentou duas vezes a atividade de lipase. Após o planejamento experimental, o novo meio de cultivo otimizado, composto por óleo de milho 0,5%, extrato de levedura 0,45%, peptona 0,2%, MgSO4.7H2O 0,012%, KH2PO4 0,015% e NH4H2PO4 0,05%, foi 3,5 vezes melhor que o original. Dessa forma, a lipase produzida demonstrou capacidade de transesterificação e pode ser utilizada para a produção de biodiesel.