背景:在辅助生殖工作中,玻璃化二次冷冻可以有效提高胚胎利用率.课题组前期研究结果显示,不同发育时期的玻璃化二次冷冻显著影响胚胎发育,但其机制尚不明确.目的:探讨不同时期玻璃化二次冷冻影响胚胎发育潜力的可能机制.方法:收集ICR小鼠体内受精的2-细胞胚胎并进行体外培养,随机分为4组:对照组、8-细胞冷冻一次组(8C)、8-细胞冷冻一次解冻后于8-细胞期(8C-8C)或培养至囊胚期(8C-BL)再次冷冻.利用免疫荧光分析囊胚期H3K4me3、H3K9me2及H3K9AC的表达水平;实时荧光定量PCR分析多能性基因Cdx2、Oct4及Sox2的转录水平.结果 与结论:①免疫荧光结果显示,一次和二次冷冻均会导致囊胚期H3K9me2(P<0.01)及H3K9AC水平显著上升(P<0.0001);②一次冷冻不影响H3K4me3水平,但二次冷冻组H3K4me3水平显著下降,且在8C-BL组下降尤为严重(P<0.0001);③实时荧光定量PCR结果显示,一次冷冻及8-细胞期二次冷冻不会影响胚胎多能性基因Cdx2、Oct4和Sox2的表达水平,但8C-BL组胚胎多能性基因表达水平显著改变,Oct4的表达水平显著下降(P<0.01),而Cdx2(P<0.001)和Sox2(P<0.01)的表达水平显著上升;④结果表明,玻璃化二次冷冻对小鼠胚胎的表观遗传具有一定的负面影响,且囊胚期二次冷冻显著影响H3K4me3修饰及多能性相关基因表达水平.