目的 建立可同时检测新生儿苯丙酮尿症(PKU)、先天性肾上腺皮质增生症(CAH)和先天性甲状腺功能减退症(CH)6种标志物的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)方法.方法 对滤纸干血片的处理条件进行优化,建立可同时检出17-羟孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(ASD)、皮质醇(COR)、苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)和甲状腺素(T4)的UPLC-MS/MS方法并进行方法学评价(线性范围、准确度、灵敏度、精密度、参考物质分析).收集正常新生儿滤纸干血片样本1 000份、CH患儿滤纸干血片样本30份,PKU患儿滤纸干血片样本30份、CAH患儿滤纸干血片样本30份.对建立的UPLC-MS/MS方法进行验证,并初步建立6种标志物筛查的参考区间.结果 UPLC-MS/MS检测PHE、TYR、17-OHP、ASD、COR、T4的线性范围分别为12.1~980.7 μmol/L、3.7~298.0 μmol/L、6.1~490.2 nmol/L、0.7~56.6 nmol/L、13.8~1 117.3 nmol/L、32.2~2 606.6 nmol/L,最低检测限分别为0.5 μmol/L、0.7 μmol/L、1.6 nmol/L、0.2 nmol/L、2.6 nmol/L、3.2 nmol/L.3个浓度水平质控品的日内精密度[变异系数(CV)]为2.2%~7.5%,日间精密度(CV)为2.3%~7.3%,加标回收率为92.5%~115.4%.国际新生儿筛查学会(ISNS)PHE和17-OHP标准物质5个浓度的检测值与标示值的相对偏差分别为1.78%~7.01%、0.70%~10.78%.相对于正常新生儿,CAH患儿17-OHP水平和(17-OHP+ASD)/COR比值升高(P<0.05),PKU患儿PHE水平和PHE/TYR比值均升高(P<0.05),CH患儿T4水平降低(P<0.05).17-OHP和17-OHP联合(17-OHP+ASD)/COR比值筛查CAH的阳性率均为100%.PHE和PHE联合PHE/TYR比值筛查PKU的阳性率均为100%.T4筛查CH的阳性率为40%.结论 建立了可同时检测PKU、CAH和CH 6种标志物的UPLC-MS/MS方法,该方法特异性强、快速、灵敏,缩短了样本分析时间,可作为新生儿疾病筛查的新方法.