[目的]制备安全、稳定的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)实时荧光定量PCR阳性对照品.[方法]人工合成含ASFV P72、CD2v和MGF360-12L基因片段的核苷酸序列,将3段基因串联插入腺病毒载体PacAd5中,将重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,培养10 d后用PCR方法检测假病毒包装情况,将制备的假病毒颗粒加冻干保护剂制备成阳性对照品,进行均一性和稳定性试验,并对制备好的阳性对照品进行核酸拷贝数的绝对定量.[结果]重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞24 h后出现点状荧光,转染后7 d细胞有形成岛屿状感染区的趋势,转染后10 d细胞出现固缩和脱落等明显细胞病变,收获的假病毒液经PCR检测和测序鉴定,结果显示,能扩增出大小约2 400 bp的阳性条带且测序序列与插入片段一致.均一性试验显示,阳性对照品Ct值的变异系数<1%,表明均一性良好;加速热稳定性试验显示,制备的阳性对照品分别经4℃放置7 d、室温(25℃)和37℃处理24 h后仍能保持稳定;阳性对照品在DNase Ⅰ作用1 h后仍具有良好的稳定性;保存期试验表明制备的阳性对照品在一20℃下可稳定保存6个月.经微滴式数字PCR(ddPCR)检测结果显示,制备的阳性对照假病毒液的核酸拷贝数为(2.26+0.09)×104拷贝/μL.[结论]本研究成功制备了含有P72、CD2v和MGF360-12L基因片段的ASFV假病毒阳性对照品,可实现对核酸提取与检测过程的全程监控.