Le cancer du sein est la deuxième cause de décès par cancer chez les femmes dans le monde et touche 1 femme sur 8 au Canada. La majorité des tumeurs du sein (~ 70 %) sont regroupées dans le sous-type luminal, qui exprime le récepteur des oestrogènes ERα, un facteur de transcription dépendant du ligand qui entraîne l'expression des gènes de prolifération et de survie. Les patients atteints de ce sous-type (tumeurs ER+) bénéficient d'une hormonothérapie, souvent basée sur l'utilisation d'un anti-oestrogène (AE) qui agit comme un inhibiteur compétitif du ERα. Le tamoxifène a été utilisé en clinique pour tous les stades du cancer du sein ER+, mais il possède une activité agoniste partielle spécifique aux gènes et aux tissus. Le fulvestrant, utilisé cliniquement en deuxième ligne après rechute ou dans le cadre ou la tumeur est à un stade avancé, est un AE pur plus efficace que le tamoxifène pour inhiber l'activité des récepteurs. Cependant, le mécanisme d'action sous-jacent à cette efficacité accrue reste mal compris. ER exerce ses effets transcriptionnels en interagissant avec un ensemble de cofacteurs - coactivateurs et corépresseurs. Afin d'en savoir plus sur l'impact des ligands sur ERα, notre objectif était d'étudier son interactome dans la lignée cellulaire cancéreuse ERα positive (ER+) ZR75.1 en utilisant la technique BioID en présence d'un agoniste (17-β-estradiol) ou d'un antagoniste (tamoxifène). Plusieurs protéines, y compris des cofacteurs connus et de nouveaux candidats, dont SNW Domain Containing 1 (SNW1), ont été identifiées par cette approche. Alors que dans le criblage BioID effectué avant cette étude, l'intensité des peptides SNW1 détectés par spectrométrie de masse en présence de ligands avait très peu augmenté par rapport à l'absence de ligands, une expérience hybride sur deux levures mesurant l'interaction de SNW1 avec un panel de récepteurs nucléaires en présence de leur ligand endogène avait suggéré que SNW1 interagit avec ERα d'une manière dépendante du ligand (Kang et al., 2009). Sur la base de ces observations, nous avons décidé d'explorer si SNW1 est un cofacteur transcriptionnel ERα. Pour valider nos résultats de BioID, nous avons d'abord évalué la proximité entre SNW1 et ERα en utilisant des tests de pull-down TurboID, de co-immunofluorescence et de ligature de proximité. Nous avons ainsi observé une colocalisation de ces protéines au sein du noyau. Ensuite, une co-immunoprécipitation a révélé la possibilité d’interactions entre ERα et SNW1, et une immunoprécipitation de chromatine effectuée sur les régions régulatrices de gènes cibles connus des récepteurs d'oestrogènes a indiqué le recrutement de SNW1. Un enrichissement plus important a été observé en présence de Fulvestrant, compatible avec un rôle de SNW1 en tant que corépresseur. Finalement, des expériences de RNAseq après suppression de l’expression de SNW1 ont révélé l’induction de la signalisation p53 et la suppression d’une signature de réponse à l’interféron. Ces signatures ont été identifiées dans les cellules de cancer du sein ER+ cultivées à long terme en absence d’oestrogènes, reliant SNW1 avec la signalisation oestrogénique et la suppression de l’activité de p53. Des expériences additionnelles seront nécessaires pour évaluer le mécanisme de l’impact de SNW1 sur ces deux voies de signalisation.
Breast cancer is the second leading cause of cancer death in women worldwide and affects 1 in 8 women in Canada. The majority of breast tumors (~ 70%) are grouped into the luminal subtype, which expresses the estrogen receptor ERα, a ligand-dependent transcription factor that drives expression of proliferative and survival genes. Patients with this subtype (ER+ tumors) benefit from hormonal therapy, often based on the use of anti-estrogens (AEs), which are competitive inhibitors of ERα. Tamoxifen has been used in the clinic for all stages of ER+ breast cancer but has gene- and tissue-specific partial agonist activity. Fulvestrant, used clinically in second line after relapse or in the advanced setting, is a pure AE more effective than tamoxifen at inhibiting receptor activity, however, the mechanism of action underlying this increased efficacy remains poorly understood. ER exerts its transcriptional effects by interacting with an array of cofactors – co-activators and co-repressors. In order to learn more about the impact of ligands on ERα, our goal was to study its interactome in an ERα positive (ER +) cancer cell line (ZR75.1) using the BioID technique in the presence of an agonist (17-β-estradiol) or of an antagonist (tamoxifen). Several proteins, including known cofactors and new candidates such as the SNW Domain Containing 1 (SNW1) protein, were identified by this approach. While in the BioID assay performed prior to this study, the intensity of SNW1 peptides detected by mass spectrometry varied little in presence or absence of ligands, a yeast two hybrid experiment measuring the interaction of SNW1 with a panel of nuclear receptors in presence of their endogenous ligand had suggested that SNW1 interacts with ERα in a ligand-dependent manner (Kang et al., 2009). Based on these observations, we decided to explore whether SNW1 is a ligand-dependent ERα transcriptional cofactor. To validate our BioID results, we first assessed SNW1 and ERα proximity using co-immunofluorescence, proximity ligation assays, and TurboID pull-down assays. We thus observed colocalization of these proteins within the nucleus. Next, co-immunoprecipitation experiments demonstrated interaction between the two proteins. Chromatin immunoprecipitation performed on enhancers of known estrogen receptor target genes indicated recruitment of SNW1 on Estrogen Response Elements (EREs) in these regulatory regions. A higher enrichment was observed in the presence of fulvestrant, compatible with role of SNW1 as a corepressor of ERα. Ultimately, RNAseq experiments performed after siRNA-mediated suppression of SNW1 revealed induction of p53 signaling and suppression of the interferon response pathway. These signatures were also identified in ER+ breast cancer cells long term cultured in the absence of estrogens, connecting SNW1 both with estrogenic signaling and p53 activity suppression. Additional experiments will be needed to evaluate the impact of SNW1 on both these signaling pathways.