Bacteria are highly versatile and able to adapt to numerous environmental conditions to ensure their survival. The formation of bacterial biofilms, a form of bacterial life, notably contribute to such protection via diverse mechanisms. In the healthcare system, most of the microbial infections are biofilm-related, including chronic opportunistic and medical devices bacterial infections, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa being among the most commonly isolated pathogens. Biofilms have an increased tolerance to both the host immune system and exogenous antimicrobials. Consequently, the biofilm lifestyle is linked with the alarming increasing rate of antimicrobial resistance worldwide. The production of the matrix serves as a shield to biofilm cells. The biofilm matrix is composed of macromolecules i.e., polysaccharides, proteins and eDNA and it has a dynamic complexity. Because of the detrimental impact of biofilms in the clinic, further explorations on factors able to alter the biofilm formation may shed some light on improving biofilm control strategies. Therefore, the main aim of this thesis project was to examine the responses of S. aureus biofilm formation to modified surfaces and newly synthesized chemical agents as well as when it was grown in co-culture with P. aeruginosa. In the first study, the ability of S. aureus to form biofilms when grown on a set of nanostructured polymer-coated surfaces was characterized by measuring cell viability, polysaccharide levels and surface-associated proteins in the biofilm matrix. The effect of two different biofilm formation assays on the S. aureus biofilm formation was also assessed. Certain surface chemistry and topography properties led to different S. aureus biofilm responses, depending on the growth assay used. The proteomics analysis showed that there were surface-associated proteins, which were differentially expressed depending upon the used biofilm formation assay and the modified surface where these biofilms were grown. Also, the expression of a subset of virulence-related proteins was shown to correlate with certain underexplored parameters of surface roughness. In the second study, a set of pyrimidine derivatives was evaluated for its S. aureus biofilm inhibition activity, followed by the chemical optimization and functional characterization of the most active compounds (9e, 10d and 10e). S. aureus biofilm was shown to be inhibited by these compounds, including established biofilms that were affected via reduction of the cell viability, total biomass and polysaccharide abundance. Additionally, structure-activity relationship study was carried out. In the third study, after establishing optimal conditions for growing S. aureus and P. aeruginosa biofilms in co-culture, a proteomics approach was used for analyzing the interactions via proteome profiles between mono- and co-cultured biofilms. Several phenotypic assays were performed and thus they confirmed the findings from the proteomics analysis. Furthermore, additional bacterial responses were studied by using the dual-species biofilms model to evaluate a subset of nanostructured polymer-coated surfaces and the most effective pyrimidine 10d. Overall, this thesis aims to provide comprehensive insights on the responses of bacterial biofilms when grown on modified surfaces with different physicochemical properties and exposed to chemical agents, which could ultimately contribute towards the development of enhanced biofilm control strategies. Bakteerit ovat monimuotoisia eliöitä, jotka kykenevät sopeutumaan erilaisiin elinolosuhteisiin varmistaakseen selviytymisensä. Biofilmi on bakteerien kasvutapa, joka edistää tätä sopeutumista suojaamalla bakteereja ympäristötekijöiltä useiden eri mekanismien välityksellä. Biofilmit liittyvät suurimpaan osaan terveydenhuollossa hoidetuista mikrobi-infektiosta, kuten kroonisiin opportunisti-infektioihin sekä lääkinnällisiin laitteisiin liittyviin infektioihin. Staphylococcus aureus- ja Pseudomonas aeruginosa -bakteerilajit lukeutuvat näistä tavallisimmin eristettyihin taudinaiheuttajiin. Biofilmeillä on kohonnut kyky sietää sekä isäntäorganismin immuunipuolustusta että mikrobilääkkeitä, ja kasvutapa on liitetty mikrobilääkeresistenssin hälyttävän nopeaan maailmanlaajuiseen lisääntymiseen. Matriksi on puolestaan rakenne, jonka biofilmi tuottaa solujen suojaksi. Se koostuu makromolekyyleistä, kuten polysakkarideista, proteiineista ja solunulkoisesta DNA:sta, ja rakenne on dynaamisesti kompleksinen. Hoidollisesti haasteellisten biofilmien muodostumiseen vaikuttavien tekijöiden tutkimusta tarvitaan torjuntakeinojen kehittämiseksi, ja tämän työn päätavoitteena onkin tutkia, miten muunnellut pinnat, uudet synteettiset yhdisteet sekä yhteisviljely P. aeruginosa -bakteerin kanssa vaikuttavat S. aureus -biofilmin muodostumiseen. Ensimmäisessä osatyössä S. aureus -bakteerin kykyä muodostaa biofilmejä erilaisilla nanorakenteisilla polymeeripinnoitteilla tutkittiin mittaamalla solujen elinkelpoisuutta sekä polysakkaridimääriä ja pintaproteiinien esiintymistä biofilmimatriksissa. Samalla tutkittiin kahden erilaisen viljelymenetelmän vaikutusta biofilmimuodostukseen. Tietyt pintakemia- ja topografiaominaisuudet saivat aikaan biofilmeissä erilaisia vasteita riippuen käytetystä kasvatusmenetelmästä. Proteomiikka-analyysillä tunnistettiin pintaproteiineja, joiden määrä vaihteli viljelytavan ja pinnoitteen mukaan, ja taudinaiheuttamiskykyyn vaikuttavien proteiinien osajoukon ilmenemisen havaittiin korreloivan eräiden vielä heikosti tunnettujen pintakarkeusparametrien kanssa. Toisessa osatyössä tutkittiin pyrimidiinijohdannaisten kykyä estää S. aureus -biofilmin kasvua, ja aktiivisimmat yhdisteet (9e, 10d ja 10e) valittiin kemiallisen rakenteen optimointiin sekä toiminnalliseen kartoitukseen. Näiden yhdisteiden todettiin paitsi estävän biofilmimuodostusta myös vaikuttavan jo muodostuneisiin biofilmeihin vähentämällä solujen elinkelpoisuutta, biofilmin kokonaisbiomassaa ja polysakkaridin määrää. Lisäksi tutkittiin näiden yhdisteiden kemiallisen rakenteen ja biologisen aktiivisuuden välisiä yhteyksiä. Kolmannessa osatyössä optimoitiin S. aureus ja P. aeruginosa -yhteisviljelmän kasvatusolosuhteet ja verrattiin puhdas- ja yhteisviljelminä kasvatettujen biofilmien proteomiprofiileja. Proteomiikka-analyysin löydökset vahvistettiin fenotyyppisillä määrityksillä. Biofilmiyhteisviljelmämallia käytettiin myös nanorakenteisten polymeeripinnoitteiden sekä tehokkaimmaksi osoittautuneen pyrimidiinijohdannaisen 10d jatkoarviointiin. Tämä väitöskirja pyrkii tarjoamaan kattavan näkemyksen vasteista, joita bakteeribiofilmeissä saadaan aikaan kasvattamalla niitä fysikaalis-kemiallisilta ominaisuuksiltaan eroavilla, muunnelluilla pintamateriaaleilla sekä koeyhdisteille altistettuna. Nämä voivat edistää tehokkaampien biofilmin torjuntakeinojen kehittämistä.