Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2020
Although the genomic landscape of non-small-cell lung cancers (NSCLC) has extensively been studied (Bailey et al., 2018; ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium, 2020), the functional validation of many putative tumor suppressor genes (TSGs) still remains elusive. Albeit cancer cell models represent valuable means to study TSG alterations, they reflect the biology of human tumors only to a certain extent (O’Loughlin & Gilbert, 2019). Hence, the utilization of genetically engineered mouse models is still critical in translational cancer research. Here, I started with the genomic characterization of 421 NSCLC patients who consented to the TRACERx cohort study (Jamal-Hanjani et al., 2017). I then leveraged somatic mutations, along with somatic copy number aberrations to prioritize a list of putative tumor suppressor genes, which were further destined for in vivo validation. The validation relied on a recent innovation where CRISPR-Cas9 mediated genome editing was coupled with molecular barcoding which enabled to decipher clonal tumor growth dynamics (Rogers et al., 2017). Therefore, I designed single-guide RNA molecules for each selected TSG and further established an efficient in vitro lentiviral assembly protocol, which prospectively facilitates high-throughput experiments. Tumors were initiated in KrasLSL- G12D/+ (KT) and KrasLSL-G12D/+;H11LSL-Cas9 (KT;Cas9) mice respectively with barcoded Lenti-sgRNA/Cre vectors. Upon digestion of bulk-tumor-bearing lungs and ultradeep sequencing of barcoded cells, the impact of inactivated TSGs was assessed. Analysis of multiregion sequencing data from TRACERx patients revealed widespread intratumor heterogeneity, where common cancer genes showed striking somatic copy number aberration patterns. By utilizing this data in a simulation-based framework, I explicitly inferred 38 TSGs, many of which are not yet acknowledged as driver genes in human lung adenocarcinoma. Examples include, the dual specificity phosphatase 6, DUSP6 or the receptor-type tyrosine-protein phosphatase beta, PTPRB. I established an in vitro Lenti-sgRNA/Cre assembly approach, which was realized with one single cloning step, thus significantly reduced time and resources investment. In addition, this protocol included a diversification step (i.e. two-component barcode) wherein the production of >106 uniquely tagged lentiviral sgRNA/Cre vectors was achieved. Finally, a novel mathematical approach is proposed which infers true bona fide cancerous lesions within bulk-tumor-bearing lungs extracted from study mice. Using this approach, I determined vast tumor size fluctuations, both within and across KT and KT;Cas9 mice respectively. Moreover, the assessment of tumor sizes in KT;Cas9 mice confirmed tumor suppressive functions of the majority of tested cancer genes. Notably, tumor suppressive activities of Tet methylcytosine dioxygenase 2, Tet2 and DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 alpha, Dnmt3a were observed, genes for which an involvement in human NSCLC are yet unrecognized. Overall, the proposed approach along with the results demonstrate the means to study TSG functions in translational mouse models at unprecedented scale and resolution.
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2020
Das Nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC) stellt die häufigste Form von Lungenkrebs dar. TRACERx (TRAcking Non-Small-Cell Lung Cancer Evolution through Therapy) ist eine gros angelegte Kohortenstudie, welche im Jahr 2014 initiiert wurde und die genomische Analyse von 1,000 NSCLC Patienten beabsichtigt. Das Hauptziel besteht darin, genetische Veränderungen in einem evolutionären Kontext zu studieren und gleichzeitig mit therapeutischen Eingriffen das Überleben der Patienten zu verlängern. Ausgehend von einer bioinformatischen Analyse von 421 sequenzierten Tumorgenomen, habe ich eine Kennzahl entwickelt, die die Relevanz und Gewichtung einzelner Mutationen in Tumor-Suppressor-Genen (TSG) repräsentiert. Mit diesem Verfahren konnte ich 38 TSGs priorisieren, wo wiederkehrende Mutationen in untersuchten Patienten einem signifikanten Muster folgten. Unter den 38 abgeleiteten TSGs befinden sich viele, von denen bis zum heutigen Zeitpunkt keine Involvierung in NSCLC bekannt sind. Da diese Analyse jedoch auf reiner computerbasierter Modellierung beruht, sind tatsachliche Auswirkungen einzelner Mutationen in biologischen Systemen weitgehend unbekannt. Um dem entgegen zu wirken, haben wir zwei Mausmodelle KrasG12/+ und KrasG12/+;H11LSL-Cas9 verwendet, um die Funktion vorher definierter TSGs, zu validieren. KrasG12/+;H11LSL-Cas9 besitzt ein ‚Cas9-allele‘, womit durch Transduktion epithelialer Lungenzellen mit ‚single guide‘ RNA Molekülen eine zielgerichtete Genom-Editierung erzielt wird. Mit diesem Verfahren können viele Gene spezifisch und parallel inaktiviert werden. Um dies zu erreichen, habe ich Lenti-sgRNA/Cre Plasmide gefertigt, die mit einer Barcodesequenz ausgestattet waren. Barcodesequenzen dienten dazu, klonale Tumore in Mauslungen zu identifizieren. Nach einer 15-wochigen Inkubationszeit wurden Mauslungen entnommen, DNA extrahiert und einer Sequenzierung zugeführt. Durch den Einsatz vorhin erwähnter Barcodesequenzen, konnten einzelne Krebszellen identifiziert und Wachstumsdynamiken determiniert werden. Die Quantifizierung von Krebszellen als auch die Definition weiterer Kennzahlen, ermöglichte die Validierung vieler Tumor-Suppressoren. Beispiele stellen das DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 alpha (Dnmt3a) oder Tet methlcytosine dioxygenase 2 (Tet2) Gen, dar. Summa summarum vermittelt diese Studie ein neues Verständnis, wie TSG Funktionen in vivo evaluiert werden können. Darüber hinaus beschreibt diese Studie einen neuen Weg in translationaler Forschung, die es ermöglicht, Genfunktionen in einem noch nie dagewesenen Ausmaß und gleichzeitiger Präzision zu studieren.