Diabetic kidney disease (DKD), a diabetes complication that affects around one in three individuals with diabetes, is the leading cause of kidney failure (also known as end stage renal disease). Typically, patients with DKD present with microalbuminuria and a decline in the glomerular filtration rate. Unfortunately, when those early clinical signs are detected, the damage to the kidney is already advanced. Thus, biomarkers for detection of DKD at its early stages and stratification of individuals with risk of DKD progression are needed to allow early interventions. Extracellular vesicles (EV) are small membrane-coated structures secreted by all cells of the body. EV cargo consists of e.g. nucleic acids, proteins, and lipids that reflect the physiological status of the parental cell. EV found in urine (uEV) are derived from cells lining the urinary tract and thus, they are an attractive source of non-invasive biomarkers for DKD (and other urinary tract diseases). However, EV field is young and despite standardization efforts there is no consensus on best practices, nor enough research done on preanalytical conditions with RNA sequencing as endpoint. In this context, the aims of this thesis were to describe best practices for uEV transcriptomic studies and to discover transcriptomic biomarkers in uEV for early detection of DKD and stratification of individuals with risk of DKD progression. In the first part of this thesis, the effect of pre-analytical variables on uEV quality was assessed. Importantly, the experimental set up included samples of individuals with type 1 and type 2 diabetes and variable levels of albuminuria which is not common in this type of studies. Assessed variables included type of urine collection (24h vs overnight), use of protease inhibitors, pre-clearing of urine before freezing, storage temperature (-20°C vs -80°C), storage time (up to 4 years), storage format (urine vs uEV), uEV isolation workflows, and use of DNAse during RNA isolation. The uEV quality was assessed by nanoparticle tracking analysis, electron microscopy, Western blotting and qPCR. For uEV RNA, the comparison between groups was based on quantity, quality and profile (micro and messenger RNA sequencing). Variables affecting uEV quality and/or RNA profile were storage temperature, DNAse treatment, and the isolation workflow. These results highlighted the importance of pre-analytical variables on downstream analytics and lead to the presentation of recommendations to handle urine and uEV with focus on transcriptomics studies. The second part of the thesis was focused on downstream analytics. First, to explore the presence of uEV reference miRNAs, an enrichment list of miRNAs commonly found in uEV isolates was created and tested for their stability on diverse uEV miRNA datasets. The enrichment list showed to be highly stable and could be further developed to be used for miRNA data normalization attempts. Second, we compared the uEV mRNA profile to the mRNA profile of a set of tissues including the kidney. This analysis placed uEV mRNA profile close to the one of the kidneys. Thus, uEV can capture kidney expression patterns and could serve as liquid kidney biopsy. Lastly, by genome-wide uEV mRNA analysis we found thirteen upregulated genes in T1D DKD. Six of the genes (MSRB1, GPX3, NOX4, MSRA, HRSP12 and CRYAB) were related to oxidative and cellular stress. These stress genes were used to derive a “stress score” which correlated with hyperglycaemia and estimated glomerular filtration rate (eGFR) decline. Importantly, these findings were replicated in independent cohorts. Thus, the stress score holds the potential to stratify individuals that are at a higher risk of developing DKD. This doctoral thesis shows that the uEV transcriptome is indeed a source of promising non-invasive kidney disease biomarkers with potential prognostic value. However, rigorous assessment of pre-analytical variables and guidelines on best practices are a must not only for generating reliable and replicable results but also to understand the limitations when comparing uEV studies. Diabetekseen liittyy noin joka kolmannella potilaalla munuaistaudin riski. Pahimmillaan tämä johtaa munuaistoiminnan menetykseen (End Stage Kidney Disease, ESKD) jonka yleisin aiheuttaja on juuri diabetes. Diabeettinen munuaistauti alkaa salakavalasti yhden verenkierron valtaproteiinin, albumiinin, poikkeavana vuotamisena munuaisten kautta virtsaan (valkuaisvirtsaisuus, albuminuria). Valitettavasti albuminurian ilmaantuminen osoittaa, että munuaisvaurio on jo edennyt. Tämän vuoksi tarvitaan yhä aikaisempia merkkiaineita ilmaisemaan munuaisvaurion riski, joka mahdollistaa tehokkaat hoitotoimet. Solunulkoiseen tilaan eritettävät rakkulat, vesikkelit (ekstracellular vesicles) ovat jokaisen elimistön solun erittämiä pallukoita jotka sisältävät elimistön nukleiinihappoja, valkuaisia, ja eri rasvoja. Niiden koostumus yhdessä kertoo isäntäsolunsa kulloisenkin aineenvaihdunnan tilanteen ja aktiivisuuden. Vesikkeleitä eritetään paitsi kaikista munuaisen soluista, mutta myös kaikkien muiden elimien vesikkelit eritetään pääasiassa munuaisen kautta virtsaan. Viime vuosien tutkimukset ovaty osoittaneet, että virtsasta havaittavat vesikkelit voivat toimia erinomaisne osuvina ja varhaisina taudin merkkiaineina. Vesikkelitutkimus on vielä nuorta ja monet tutkimusmenetelmätkin vaativat vielä kehittämistä. Tämän väitöskirjan ensimmäinen osa käsittelee ja kehittää vesikkelianalytiikan menetelmiä erityisesti nuoruusiän mutta myös aikuisiän diabeteksessä virtsa-analytiikan menetelmiä kehittäen. Menetelmäkehityksessä huomioitiin seuraavat tekijät: virtsan keräys ja säilytys; virtsan valkuaishajoamisen estävät kemikaalit; virtsan käsittelymenetelmät ennen säilytystä; vesikkeleiden eristysmenetelmät ja DNA-rakenteita pilkkovien entsyymien käyttö RNA eristyksessä. Analyyseissä käytettävien vesikkeleiden laatua tutkittiin muiden muassa elektronimikroskooppisesti ja tarkoilla valkuais -ja RNAanalytiikan menetelmillä. Näiden tutkimusten avulla pystyttiin määrittämään ja kehittämään parhaat tutkimuskäytännöt. Tutkimusten toisessa osassa selvitettiin tarkkojen tutkimusmenetelmien valintaa ja kehitettiin soveltuvat menetelmät mm mikroRNAn säilymistä ja analysointia varten. Löydetyt vesikkeleiden mikroRNA ”sormenjäljet” pystyttiin RNA-analytiikan menetelmin varmistamaan. Edelleen työssä selvitettiin lähettiRNAn säilyvyyttä ja tarkkuutta, jolla virtsan lähettiRNA heijastaa itse kudoksen lähettiRNAn rakennetta normaalihenkilöillä ja miten tämä muuttuu diabeteksessä. Tutkimus osoitti, että virtsan ja kudoksen lähettiRNA muutokset vastaavat tarkasti toisiaan. Tämä mahdollistaa tulevaisuudessa potilaille merkittävästi helpomman diagnoosin teon virtsa-analytiikan keinoin korvaamaan munuaisesta otettavaa koepalaa. Edelleen tutkimuksissa löysimme kolmetoista mielenkiintoista lähettiRNA -lajia virtsan vesikkeleistä jotka tarkasti kuvastavat muutoksia erityisesti nuoruusiän diabetestä sairastavilla potillailla. Näiden lähettiRNA lajien perusteella pystyimme vesikkeleistä määrittämään stressikertoimen, joka tarkasti kuvastaa diabeteksen kehittyviä munuaisvaurioita varhaisvaiheesta lähtien. Erityisen arvokas löydös oli, että pysyimme toistamaan stressikertoimen löydökset eri kerätyistä potilasvirtsa-aineistoista. Tämän perusteella pystytään tulevaisuudessa yhä tarkemmin ennakoimaan helpoilla virtsatestillä diabetikot, joilla on riski sairastua munuaisvaurioon. Tämä väitöskirjakokonaisuus osoittaa, että virtsan vesikkelianalytiikan avulla voidaan kehittää tarkkoja menetelmiä varhaisen munuaisvaurioriskin osoittamiseen diabeetikoilla.