Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is a dangerous viral pathogen that causes a severe neurological disease. Like other members of the Flavivirus family, the virus has a positive-strand RNA genome that forms a nucleocapsid (NC) with multiple copies of the capsid (C) protein. The NC is surrounded by a lipid envelope derived from host membranes. The viral envelope (E) and membrane (M) proteins are embedded into the bilayer, and form an icosahedrally symmetric lattice on the virion surface. The aim of my thesis work was to understand what sets TBEV apart from other flaviviruses, as well as to increase our knowledge of TBEV particle assembly. To identify open questions in the field, I performed a literature review on TBEV structural biology. My review highlighted that despite the danger it poses, TBEV has been under-studied, especially in comparison to other flaviviruses. Consequently, our understanding of TBEV biology relies heavily on extrapolation from other species, and many aspects of the virus’ lifecycle remain unknown. To better understand the unique features of the TBEV virion, I purified the virus, and used cryogenic electron microscopy (cryo-EM) combined with single-particle reconstruction to build a 3.3 Ångström-resolution three-dimensional model of the virus. The reconstruction revealed a novel M protein conformation that may be unique to TBEV based on sequence alignment. Additionally, the cryo-EM reconstruction allowed me to characterize the protein-protein and protein-lipid contacts that affect TBEV virion stability. I discovered that the M proteins form lateral contacts on the virion surface, stabilizing the virus. These interactions compensate for the lack of E-E contacts in TBEV compared to other flaviviruses. Additionally, I showed that the E and M proteins coordinate ordered phosphatidylcholine molecules that increase the stability of the virion. Despite the central role the envelope plays in particle stability and virus entry, the contribution of lipid interactions in virion assembly has received little attention. To understand the role of lipids in NC formation, I investigated the C protein interactions with membranes. I used liposome sedimentation assays, quartz-crystal microbalance with dissipation monitoring measurements with supported lipid bilayers, and Langmuir-Blodgett trough-based tensiometry to characterize the interactions of the C protein with membranes. I showed that the C protein can bind and insert into membranes only in the presence of lipids with negatively-charged headgroups and that it can recruit RNA while membrane-bound. I characterized the TBEV lipidome and observed that the lipids the C protein needs for membrane binding to are also incorporated into the virion envelope confirming the physiological relevance of the biophysical findings. My results show that while there are commonalities between flaviviruses, generalising from one taxon to the others is not always applicable, and thorough investigation is needed to establish pan-flaviviral characteristics. Additionally, it is evident that both protein-protein and protein-lipid interactions play important roles in TBEV biogenesis and particle stability, and merit further study. Puutiaisaivokuumevirus (tick-borne encephalitis virus, TBEV) on hengenvaarallisia hermosto-oireita aiheuttava patogeeni, joka kuuluu Flavivivirus-sukuun. Muiden suvun edustajien tavoin TBEV-virioni koostuu positiivisjuosteisesta RNA-genomista, jota ympäröi kapsidiproteiinista (capsid, C) rakentunut nukleokapsidi. Nukleokapsidia ympäröi isäntäsolulta ryöstetyistä lipideistä koostuva vaippa, johon viruksen pintaproteiinit M (membrane, ”kalvo”) ja E (envelope, ”vaippa”) ovat kiinnittyneet. Väitöskirjatyössäni tutkin TBEV-partikkelien rakentumista sekä sitä, kuinka TBEV eroaa muista flaviviruksista rakenteellisesti. Ensimmäiseksi kirjoitin katsausartikkelin TBEV:n rakennebiologiasta ymmärtääkseni, mitkä osat viruksen elinkierrosta ovat huonosti tunnettuja. Katsaus osoitti, että vaarallisuudestaan huolimatta TBEV:tä on tutkittu huomattavasti muita flaviviruksia vähemmän. Tämän lisäksi selvisi, että NC:n rakentumisprosessin eri vaiheet ovat epäselvät kaikille Flavivirus-suvun edustajille. Ymmärtääkseni paremmin TBEV-virionin omalaatuisia piirteitä, rakensin siitä kolmiulotteisen kryoelektronimikroskopiarekonstruktion. Mallin resoluutio oli 3,3 Ångströmiä, mikä mahdollisti tärkeimpien TBEV-virionia koossa pitävien molekulaaristen vuorovaikutusten kuvaamisen. Rekonstruktion perusteella TBEV-partikkelissa M-proteiini on aikaisemmin tuntemattomassa konformaatiossa, joka saattaa olla uniikki TBEV:lle sekvenssilinjauksen perusteella. M-proteiinin uusi konformaatio johtaa virionin rakennetta vahvistavien M-M-vuorovaikutusten muodostumiseen viruspartikkelin pinnalla. Nämä kompensoivat vastaavien E-E-vuorovaikutusten vähäisempää määrää muihin flaviviruksiin verrattuna. Rekonstruktio osoitti myös, että E- ja M-proteiinit muodostavat kaksi lipidimolekyylejä sitovaa taskua, jotka ylläpitävät virionin rakennetta. Tutkin TBEV-nukleokapsidin rakentumista selvittämällä, mikä on lipidikalvojen rooli prosessissa. Käytin liposomisedimentaatiokokeita, kvartsikristallinmikrovaakamittauksia yhdistettynä tuettuihin lipidikaksoiskalvoihin sekä tensiometriaa Langmuir-Blodgett-kaukalossa. Havaitsin, että C-proteiini tarvitsee negatiivisesti varautuneita lipidejä sitoutuakseen kalvoihin. Tämän lisäksi tutkimukseni osoitti, että C proteiini kykenee työntymään kalvojen sisään, sekä sitomaan paikalle RNA:ta kalvoihin kiinnittyneenä. Kuvasin myös TBEV-lipidomin käyttäen massaspektrometriaa ja varmistin samalla aikaisempien havaintojeni biologisen merkityksen, sillä tulosteni perusteella C-proteiinin sitoutumiseen tarvittavia varautuneita lipidejä päätyy myös virionin vaippaan. Tutkimukseni osoittaa, että vaikka flavivirukset ovat monin tavoin samankaltaisia, ei yksittäisistä taksoneista voi välttämättä vetää suoria johtopäätöksiä toisiin. Tämän lisäksi tutkimukseni myötä on selvää, että TBEV-partikelin rakentuminen ja koossa pito vaatii useita proteiini-proteiini- ja proteiini-lipidivuorovaikutuksia, joita on tutkittava lisää.