Background: Stroke is the third leading cause of death, and a significant cause of disability. Approximately 20% of ischemic strokes are due to carotid atherosclerosis, characterized by the formation of lipid-rich inflammatory cell collections inside the intima of the carotid bifurcation – carotid plaques. The main cell type is a macrophage foam cell, the archetypal cell of the atherosclerotic plaques. When a plaque proceeds to a vulnerable phenotype, it manifests itself with clinical symptoms. The most common mechanism is the rupture of the fibrous cap overlying the lipid core of the plaque, followed by local thrombosis and embolization, ultimately leading to cerebral infarction. Plaques are common, but most will remain clinically silent. The main treatment of carotid atherosclerosis is primary and secondary prevention with pharmacotherapy and lifestyle interventions. In advanced symptomatic atherosclerosis, carotid endarterectomy can be used for stroke prevention. However, selecting the treatment option is not clear-cut. For example, many currently surgically treated patients are potentially curable by modern pharmacotherapy alone, while other asymptomatic patients – those who had a catastrophic plaque-originated ischemic stroke – would have benefited from more accurate assessment of the vulnerability of the carotid plaque and surgery as the primary prevention. The pathobiology behind the progression of the carotid plaque into a vulnerable phenotype is still unclear, and there are no clinical methods to evaluate it. This is a core question not only in carotid atherosclerosis, but also in other cardiovascular diseases such as coronary artery disease. This study aims at characterizing selected symptom-associated genes inside carotid plaques to generate hypotheses about the cellular events associated with plaque vulnerability. Methods: 92 clinically well-characterized stroke, TIA or asymptomatic patients underwent carotid endarterectomy due to high-grade (>70%) carotid stenosis in 1997–2000 at the Helsinki University Central Hospital, and their plaques were collected. A DNA microarray analysis in a sub-group of radiologically confirmed asymptomatic and stroke-causing plaques showed 60 genes with significant expression differences between the symptomatology groups. Some of the genes were previously almost unknown for clinically symptomatic carotid atherosclerosis. The protein products of six of these genes – ADFP, CD36, ABCA1, CD163, HO-1 and GLUL – were studied with a detailed map-style immunohistochemical methodology, which combined semi-quantitatively assessed protein expression level in each plaque (1–2 mm2 area), amount of the most common molecular and cellular stressors inside the plaques, and the histopathological features of the plaques. This analysis was supported by protein quantification in some of the studies. The immunohistochemical findings were compared with macroscopic plaque data and clinical data, as well as with the previously published data from the same patients on other genes found in the original DNA microarray work. An advanced statistical methodology was designed for each study by a professional statistician. Results: We found meaningful spatial associations between macrophage protein expression and different local pathological plaque constituents, in line with previous evidence. The lipid droplet protein ADFP associated with erythrocytes and cholesterol clefts, indicating their role in foam cell formation. The relationship between CD36 and ABCA1 seemed to favor lipid loading in ruptured carotid plaque macrophages, supporting the theory of dysregulated lipid loading as a factor in plaque progression into a vulnerable phenotype. GLUL, CD36, ABCA1, CD163 and HO-1 also associated with intraplaque hemorrhages. The local GLUL association with the studied local pathological factors was more pronounced in symptom-causing plaques. Higher local GLUL associated with a thinner fibrous cap, a phenomenon linked with plaque vulnerability. Based on the results, we formulated the first theory about the significance of GLUL in atherosclerosis. Conclusions: The pattern of how plaque pathology-promoting factors and molecules such as iron and erythrocytes associated with most of the studied genes suggested that antiatherosclerotic macrophages were found in many pathological plaque regions. The previous literature from GLUL in other disease states and cell cultures supported the role of GLUL as an evolutionarily highly conserved, life sustaining molecule. On the contrary, it was highly associated with multiple types of different pathology-promoting features, indicating that it might be linked with plaque pathogenesis rather than antiatherogenic macrophage activity. This led to a shift in the view about atherosclerosis. The question “What is wrong with the biology when atherosclerosis develops?” transformed into the question “Why do biologically meaningful responses produce atherosclerosis?” This question was analyzed in light of evolution. Certain pathological alterations and cellular problems might be due to evolutionarily ‘outdated’ mechanisms in the human. The ancient macrophage may not be programmed for phagocytosing decades of excess lipoproteins, a threat faced by man in the modern era of overnutrition, eventually leading to heightened vulnerability of the plaques. Taustaa: Noin 20% iskeemisistä aivoinfarkteista johtuu kaulavaltimoateroskleroosista. Taustalla oleva ateroskleroottinen tautiprosessi synnyttää sisempään kaulavaltimoon kolesterolista, makrofageista ja kalkista koostuvan rasvaytimen eli plakin valtimon seinämän sisään. Vuosikymmenten saatossa kroo-ninen tulehdus haurastuttaa valtimon seinämää, lopulta johtaen plakin sidekudoskaton repeämään. Revenneen plakin kohdalle syntyvä suonensisäinen verihyytymä voi aiheuttaa massiivisen aivoinfark-tin emboloituessaan verenkierron mukana aivovaltimoihin. Ateroskleroosia ilmenee useimmissa suu-rissa valtimoissa. Sen pääasiallinen hoito on primaaripreventio lääkityksin ja elintapamuutoksin. Oirei-levia ahtaumia voi sekä kaula- että sepelvaltimoissa hoitaa myös kirurgisin toimenpitein. Kaulavalti-moendarterektomia on oikein valituille potilaille tehokas tapa aivoinfarktin estoon, mutta toimenpide sisältää riskinsä. Lisäksi huomionarvioista on, että suurin osa aivoinfarkteista on ensimmäisiä infarkte-ja, eli primaaripreventio on näillä potilailla myöhässä. Tällä hetkellä ei ole mitään kliinistä muuttujaa, jonka perusteella voitaisiin valita leikkauksesta eniten hyötyvät potilaat. Ateroskleroottiset muutokset ovat on erittäin yleistä, mutta vain harva potilas oireilee. Silti ateroskleroosiin liittyvät sairaudet ovat maailman johtavia kuolinsyitä. Tämä tutkimuksen tarkoitus on tutkia oireilevaan ateroskleroosiin liit-tyviä geenejä ja näin täyttää mustia laatikoita ateroskleroosin patofysiologiassa. Metodit: Vuosina 1997-2000 operoitiin 92 potilasta, joilla oli sisemmän kaulavaltimon merkittävästi ( > 70 %) ahtauttava plakki. Potilaat olivat aivoinfarktin saaneita, oireettomia tai ohimenevästä aivove-renkiertohäiriöstä kärsineitä. DNA-mikrosirutekniikalla vertailtiin oireen aiheuttaneiden ja oireettomien ahtaumien geeniekspression eroja. Tässä väitöskirjatyössä on tarkemmin analysoitu 6 näistä 60 geenis-tä: ADFP, CD36, ABCA1, HMOX1, CD163 ja GLUL. Ensisijainen metodi oli yksityiskohtainen kartta-tyyppinen immunohistokemiallinen analyysi, jossa tutkittiin valomikroskoopilla kokonaisia pitkittäisiä leikkeitä kaulavaltimoahtaumista jakaen ne 1-2 mm2 alueisiin. Tutkittujen geenien lisäksi näiltä alueilta arvioitiin niiden sijainti ja useita erilaisia tekijöitä, jotka on liitetty ateroskleroosia edistävään solutoi-mintaan. Proteiiniekpressio analysoitiin Western blot- ja ELISA-menetelmin. Tilastollinen analyysime-netelmä suunniteltiin kuhunkin tutkimukseen yhdessä tilastotieteilijän kanssa. Tulokset: Aiemmin tunnettujen geenien osalta tulokset viittasivat biologisesti johdonmukaisiin makrofagien geeniekpression muutoksiin suhteessa plakin sisäisiin, paikallisiin ärsykkeisiin kuten rautaan, punasoluihin ja kolesterolikiteisiin. ADFP-geenin merkitys plakinsisäisen vuodon aiheuttamassa vaahtosolunmuodostuksessa vahvistui tutkimuksessamme. Rasvaa soluun sisään ottavan CD36-proteiinin ja solusta sitä poistavan ABCA1-proteiinin suhde vaikutti suosivan rasvan soluunottoa repeytyneissä kaulavaltimoahtaumissa. Kaikki tutkitut geenit assosioituvat plakin sisäisiin verenvuotoihin. GLUL esiintyi samanaikaisesti useiden valtimon seinämässä tavattavien patologisten tekijöihin ja ateroskleroottisten muutosten kanssa, ja GLUL:n suhde näihin muutoksiin oli suurempi oireen aiheuttaneissa ahtaumissa. GLUL-proteiinin ekspressio liittyi ohenevaan plakin side-kudoskattoon, mikä on ilmiö, jonka on katsottu olevan merkittävä tekijä plakkiperäisten aivoveren-kiertohäiriöiden synnyssä. Tutkimuksen tuloksista muodostui ensimmäinen teoria GLULn merkityk-sestä ateroskleroosissa. Yhteenveto: Tapa, jolla plakin sisäiset patologiset tekijät, kuten punasolut ja rauta, liittyivät tutkittuihin geeneihin, viittasi antiateroskleroottiseen eli ateroskleroosia vähentävään ja kudosta korjaavaan makrofagien toimintaan siellä, missä näitä patologisia tekijöitä oli nähtävissä. Aiemmat julkaisut GLULn ja sen lopputuotteen glutamiinin merkityksestä solutoiminnan tehostajana ja suojaajana olivat ristiriidassa tulosten kanssa viitaten siihen, että enemmän GLULia ilmentävät makrofagit saattoivatkin olla haitallisia ahtaumissa. Miksi hyödylliseltä ja mielekkäältä vaikuttavat biologiset mekanismit liittyivät enemmän oireilevaan kuin oireettomaan ateroskleroosiin? GLUL on eräs vanhimpia tunnettuja entsyymejä, aina ajalta ennen pro- ja eukaryoottien eriytymistä, ja sillä on tehostava vaikutus mm. makrofagin fagosytointikapasiteettiin. Tämä ja muut evoluution valossa vanhat solumekanismit voivat kuitenkin aiheuttaa makrofageille ongelmia niiden taistellessa ihmiskunnan historiassa varsin nuorta ilmiötä eli vuosikymmeniä kestävää ylenmääräistä rasvan saantia vastaan, johtaen lopulta ateroskleroottisen plakin oireellisuuteen.