Cystatin B (CSTB) is a protein that functions as a potent inhibitor of papain-like cysteine proteases. Biallelic loss-of-function mutations in the CSTB gene underlie human neurological diseases of variable severity and age of onset: A total loss of CSTB expression causes a rapidly progressing microcephaly manifesting soon after birth, whereas an incomplete loss of CSTB expression leads to progressive myoclonus epilepsy type 1 (EPM1), a neurodegenerative disease with onset between ages 6 and 15 years. Previous studies have focused on identifying the phenotypes associated with CSTB-deficiency both in human patients and in a Cstb knockout mouse strain (Cstb-/-). Despite the progress made, the exact physiological role of this protein is missing. Therefore, the molecular mechanisms downstream of CSTB-deficiency remain poorly understood. The bulk of knowledge predicts a pivotal role for CSTB in regulating brain development, maturation and neuronal survival. Owing to its nuclear localization in immature cells, we hypothesized that CSTB acts as a regulator of lysosomal cysteine proteases moonlighting in the nucleus during normal brain development. To investigate the neurodevelopmental role of CSTB, we established an in vitro model of neural stem cell renewal and differentiation derived from the embryonic mouse brain. We performed the experiments parallelly in wild type and in Cstb-/- mice. We found that new-born neurons undergo limited proteolysis of the N-terminal tail of histone H3 (H3 cleavage) between alanine 21 and threonine 22 (histone H3 cleavage site 1, H3cs1) by cysteine cathepsins B and L. CSTB-deficiency elicits premature H3 cleavage in undifferentiated neural progenitors (NPC) and enhanced H3 cleavage during neurogenesis. Histone proteolysis has been implicated in gene expression reprogramming during cell state transitions. Accordingly, Cstb-/- NPCs exhibit time-resolved transcriptional alterations with matching functional defects, highlighting delayed activation of nuclear-encoded mitochondrial genes and impaired mitochondrial respiratory function during differentiation. To investigate the role of CSTB in the regulation of H3 cleavage during postnatal brain development and maturation, we continued by characterizing the timeline and distribution of H3cs1 in brains of postnatal wild type and in Cstb-/- mice. We found that H3cs1 is downregulated during postnatal weeks three and four, a temporal window marked by the maturation of neuronal circuits and refinement of cellular identities. Unlike controls, Cstb-/- mice display persistent H3 cleavage until adulthood, with the most prominent difference observed immediately before the symptomatic onset of the disease. The overproduction of H3cs1 has been reported in the context of cellular senescence. Accordingly, we show that the pre-symptomatic Cstb-/- mouse cerebellum recapitulates several phenotypes compatible with cellular senescence concomitant with the dysregulation of H3 cleavage. Finally, we provide evidence indicating that CSTB acts as a specific inhibitor of the chromatin-bound pool of cathepsin L in vivo. Collectively, our findings establish CSTB as a critical regulator of nuclear cathepsin L signalling in the mouse brain. Dysfunction of this pathway is likely to have a central role in the pathophysiology of CSTB-deficiency. Kystatiini B (CSTB) on proteiini, jonka tehtävänä on estää ja säädellä kysteiiniproteaasi-nimisten molekyylileikkurien aktiivisuutta. Sen toimintaa estävät mutaatiot CSTB-geenissä aiheuttavat kahta vakavuudeltaan ja alkamisiältään vaihtelevaa keskushermoston sairautta. CSTB:n täydellinen puutos johtaa pian syntymän jälkeen esiintyvään ja nopeasti etenevän pienipäisyyteen eli mikrokefaliaan. CSTB:n osittainen puutos sen sijaan aiheuttaa tyypin 1 etenevää myoklonusepilepsiaa (EPM1), hermorappeumasairautta, joka ilmenee yleensä 6-15 vuoden iässä. Aiemmat tutkimukset ovat kartoittaneet CSTB-puutoksen vaikutuksia sekä potilaissa että CSTB-puutteisessa (Cstb-/-) hiirikannassa, mutta huolimatta monista löydöksistä, CSTB:n tarkka tehtävä on edelleen tuntematon. Tästä syystä molekyylitason mekanismeja, jotka liittävä CSTB-puutteen aivojen sairauteen, ymmärretään vielä huonosti. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että CSTB-proteiinilla on keskeinen rooli aivojen kehityksessä ja kypsymisessä sekä hermosolujen eloonjäännissä. Sytoplasmisen sijainnin lisäksi CSTB-proteiinia on havaittu tumassa erityisesti erilaistumattomissa soluissa. Tämän vuoksi oletamme sen säätelevän lysosomaalisten kysteiiniproteaasien vaihtoehtoisia, tumassa tapahtuvia toimintoja aivojen normaalin kehityksen aikana. Voidaksemme tutkia CSTB:n tehtävää hermoston kehityksessä olemme pystyttäneet hiiren sikiöaikaisista aivoista in vitro -mallin, joka havainnollistaa hermokantasolujen uusiutumista ja erilaistumista sekä terveessä että Cstb-/--hiirikannassa. Tutkimuksemme osoittavat, että kysteiinikatepsiinit B ja C leikkaavat histoni H3 -proteiinin N-terminaalisen häntäosan vastasyntyneissä hermosoluissa normaalin kehityksen aikana, ja tämä on oleellista solun epigeneettisen muistin säilyttämiselle. CSTB:n puute johtaa H3-hännän ennenaikaiseen leikkaamiseen erilaistumattomissa hermokantasoluissa (NPC) ja leikkauksen tehostumiseen hermosolujen erilaistuessa. Histonihäntien leikkaaminen on liitetty geenien ilmenemisen uudelleenohjelmointiin solutyypin muuttuessa erilaistumisen aikana. Täten myös CSTB-puutteisissa hermokantasoluissa esiintyy ajallisesti toisiaan vastaavia transkriptionaalisia ja toiminnallisia muutoksia. Tällaisia ovat erityisesti tumassa tuotettujen mitokondriaalisten proteiinien myöhästynyt geeniaktivaatio ja mitokondrion hengitysketjun toiminnan heikentyminen hermosolujen kehityksen aikana. Ymmärtääksemme CSTB:n roolia histoni H3 -hännän leikkaamisessa aivojen syntymänjälkeisen kehityksen ja kypsymisen aikana karakterisoimme leikatun H3-hännän esiintymistä villityypin ja Cstb-/--hiirten aivoissa. Tutkimuksemme osoittavat, että histonihäntien leikkaaminen päättyy normaalisti 3-4 viikkoa syntymän jälkeen, mikä vastaa aikaikkunaa, jossa hermoverkkojen kypsyminen ja hermoston solutyyppien vahvistuminen tapahtuu. Toisin kuin kontrollieläimillä, Cstb-/--hiirillä histoni H3 -häntien leikkaaminen jatkuu pitkälle aikuisuuteen. Ero villityypin hiiriin on kaikkein suurin juuri sairauden oireiden ilmetessä. Histoni H3 -hännän leikkaus on liitetty erityisesti solujen ikääntymiseen eli senesenssiin. Näytämme, että Cstb-/--hiiren pikkuaivoissa on ikääntymiseen viittaavia merkkejä jo ennen sairauden oireiden alkamista ja tämä osuu yksiin H3-häntien leikkaamisen kanssa. Lisäksi osoitamme, että CSTB toimii erityisesti DNA:han sitoutuneen katepsiini L:n pilkonnan estäjänä in vivo. Yhteen vedettynä tutkimuksemme viittaavat siihen, että CSTB:llä on tärkeä rooli tuman katepsiini L -signaloinnin säätelijänä hiirten aivoissa. Näiden signalointireittien virheellisellä säätelyllä on todennäköisesti keskeinen rooli CSTB-puutoksesta johtuvassa patogeneesissä.