Alzheimer���s Disease is the most common neurodegenerative disease and characterized by neuronal degeneration, which leads to cognitive impairment. Due to yet unknown mechanisms misfolded Amyloid-�� (A��) accumulates and deposits on neurons, followed by destabilization of neurons and pro-inflammatory processes within the brain. Until now, there is no effective treatment to prevent or to slow down Alzheimer���s Disease progression. In this context, passive immunization trials come up to fore as most promising approaches. Pathological peptides are marked by antibodies and mediated to surrounding phagocytozing macrophages, which are represented by microglia in the CNS. However, clinical studies on passive immunization trials failed due to ineffective cognitive stabilization. In this context, the aim of the here presented study was a physiological approach of passive immunization using already existing naturally occurring autoantibodies (nAbs). NAbs detect autoantigens, such as misfolded A�� and mediate them to macrophages (nAbs-A��). Until now, they were enriched from commercially available intravenous immunoglobulins of class G (IVIg). However, their availability is restricted to blood donations. Therefore, we investigated on the recombinant production of nAbs-A��. By the single isolation of A��-reactive B1 cells from healthy donors, we were able to identify the antibodies��� Ig-genes. Thereby, we could produce three recombinant human antibodies in IgG format as well as one antibody in an altered single chain (scFv-Fc) construct. Using different binding and functional assays we identified the altered B07 scFv-Fc antibody as most promising candidate for a passive immunization approach as it showed the most positive results in all used assays. Further investigation on the glycosylation pattern of the recombinant antibodies showed a possible deficiency of recombinant antibodies in general. The antibody���s stability as well as the Fc-receptor mediated functions could massively be altered due to the specific glycosylation of the used HEK cells. For further immunization trials with recombinant antibodies the glycosylation pattern should be considered and potentially modified by specific ���glycoengeneering���. However, as we used murine cell culture systems, the study is limited by the species barrier between human and mice. Therefore, the results could be influenced using murine cells, which could induce further immunological reactions. In conclusion, by the enrichment of B1 cells from healthy blood donations four recombinant A��-reactive antibodies were produced and tested. Thereby, the multimeric B07 scFv-Fc antibody expressed the most positive outcome in comparison to nAbs-A�� and could be investigated in further passive immunization approaches to slow down the progression of Alzheimer���s Disease or even prevent its occurrence. By the application of the potential antibody as early as possible A�� molecules could be led to phagocytosis before they deposit and get pathological. As the multimerized B07 antibody showed reactivity against monomeric as well as oligomeric A�� both aggregation states could be phagocytized. In addition, due to its multimerization the B07 showed a higher avidity and thereby reflects a more efficient A�� clearance. However, a general disadvantage of passive immunization is the half-life of antibodies, which make applications at regular intervals necessary to be effective. By the change of the glycosylation pattern the antibody stability could be increased, whereby the antibody would be longer available. Thus, the used antibody concentration could be decreased and side-effects, such as edema, will decreased as well. Nevertheless, it is not clarified if the antibodies enter the brain to bind A�� or the mechanism function in the periphery. By the combination of the multimerized A��-reactive antibody B07 and the modifications of the glycans a potential antibody could be used against AD.
Die weltweit h��ufigste neurodegenerative Erkrankung ist die Alzheimer-Erkrankung. Sie ist durch das Absterben von Neuronen gekennzeichnet mit der Folge einer chronisch fortschreitenden kognitiven Beeintr��chtigung. Durch bisher ungekl��rte Mechanismen werden in der Pathogenese vorrangig Amyloid-�� (A��) Peptide prozessiert, welche sich fehlgefaltet zu neurotoxischen Oligomeren zusammenlagern, an Neuronen ablagern und somit destabilisieren. Bisher gibt es kein effektives Therapeutikum, welches die Pathogenese durch die Oligomerbildung verhindert. Die passive Immunisierung mittels Antik��rpern stellt einen vielversprechenden Ansatz dar. Dabei wird A�� durch Antik��rper markiert und durch umliegende Makrophagen phagozytiert. Bisherige klinische Studien dazu blieben jedoch bisher ohne Erfolg. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf einen physiologischen Ansatz der passiven Immunisierung mittels nat��rlich vorkommender Autoantik��rper (nAbs), welche u.a. fehlgefaltetes A�� erkennen und Makrophagen zuf��hren (nAbs-A��). Dabei wurden sie bisher als Teil kommerzieller Intraven��ser Immunglobulin-Pr��parate (IVIg) aufgereinigt. Da diese therapeutische Quelle jedoch in ihrer Verf��gbarkeit limitiert ist, wurde in dieser Arbeit eine rekombinante Herstellung dieser Antik��rper erprobt. Durch die Isolation einzelner A��-reaktiver B1-Lymphozyten aus gesunden Spendern konnten die Ig-Gene identifiziert werden, auf deren Grundlage drei rekombinante humane Antik��rper im IgG Format, sowie einem in dem ver��nderten Einzelketten (scFv-Fc) Format, hergestellt wurden. Durch Bindungs- und funktionelle Analysen konnte dabei der B07 scFv-Fc Antik��rper in allen Experimenten die positivsten Ergebnisse aufweisen und somit als der in dieser Arbeit vielversprechendste Antik��rperkandidat f��r zuk��nftige passive Immunisierungsstudien identifiziert werden. Die Analyse des Antik��rper Glykosylierungsmusters hat zudem eine m��gliche Schwachstelle rekombinanter Antik��rper allgemein aufgezeigt. Durch die spezifische Glykosylierung von verwendeten HEK-Zellen werden sowohl die Stabilit��t des Antik��rpers als auch die Fc-Rezeptor-vermittelten Funktionen essenziell beeintr��chtigt. F��r weitere Immunisierungsversuche sollte demnach das Glykosylierungsmuster ber��cksichtigt und eventuell durch spezifisches ���Glyco-engeneering��� optimiert werden. Die Aussagekraft der Arbeit wird jedoch durch den Einsatz von murinen Zellsystemen limitiert. So k��nnen die Beobachtungen teilweise nur bedingt gewertet werden, da die Ergebnisse durch die Speziesbarriere Maus-Mensch beeinflusst und zudem weitere immunologische Reaktionen hervorrufen werden k��nnten. Zusammenfassend konnten mithilfe aufgereinigter Blutspenden gesunder Probanden rekombinante A��-reaktive Antik��rper generiert werden, wovon der B07 im multimeren scFv-Fc Format eine vergleichbare Effizienz zu nAbs-A�� aufweist und somit f��r eine zuk��nftige passive Immunisierung eingesetzt werden k��nnte, um den Verlauf der Alzheimer Erkrankung zu verlangsamen bzw. fr��hzeitig zu unterbinden. Durch den fr��hestm��glichen Einsatz mit einem geeigneten Antik��rper k��nnten A�� Molek��le abgefangen und verstoffwechselt werden bevor sie sich ablagern und pathologisch wirken. Da sich der multimerisierte B07 Antik��rper sowohl gegen monomeres als auch gegen oligomeres A�� reaktiv gezeigt hat w��rden zudem verschiedene Aggregationsformen zur Phagozytose geleitet werden und so auch bereits zusammengelagerte A�� Molek��le binden. Zudem zeigt der Antik��rper auch eine h��here Avidit��t und dadurch eine effizientere Bereinigung von A��. Generell nachteilig an einer passiven Immunisierung zeigt sich die Halbwertszeit von Antik��rpern, wodurch diese in regelm����igen Abst��nden appliziert werden m��ssten, um fortgehend wirken zu k��nnen. Eine zus��tzliche Ver��nderung des Glykosylierungsmusters kann die Stabilit��t steigern und die Antik��rper l��nger verf��gbar machen, wodurch die applizierte Konzentration vermutlich gesenkt werden kann und dadurch weniger Nebenwirkungen, wie ��deme, auftreten. Jedoch ist bisher noch nicht gekl��rt, inwiefern die eingesetzten Antik��rper hirng��ngig sind oder ob sie das freigesetzte A�� peripher binden und dort der Verstoffwechslung zuf��hren. Durch die Kombination des multimerisierten A��-reaktiven Antik��rpers B07 und den Ver��nderungen der Glykane k��nnte ein geeigneter Antik��rper gegen die Entstehung der AD eingesetzt werden.