目的:构建性别决定区 Y 盒 17 (SOX17) 过表达慢病毒载体, 使用 SOX17 过表达慢病毒 感 染 PC12 细 胞 并 建 立 稳 定 过 表 达 SOX17 的 细 胞 系。方 法:在 NCBI 数 据 库 中 查 找、设 计 并 合 成 SOX17 过 表 达 序 列, 将 其 与 经 BamHⅠ 和 AgeⅠ 双 酶 切 的 慢 病 毒 GV492 载 体 连 接, 构 建 GV492-SOX17 过表达重组质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物, 筛选携带 GV492-SOX17 过表达重 组质粒的阳性菌, 克隆后测序。将 GV492 空载质粒和 GV492-SOX17 过表达 重 组 质 粒 分 别 转 染 至 人 胚 肾 HEK 293T 细胞中, 转染 48 h 后收集 GV492 对照慢病毒和 GV492-SOX17 过表达慢病毒进行包装 并 测 定 病 毒 滴 度。将 PC12 细 胞 分 为 空 白 组、GV492 对 照 组 和 GV492-SOX17 组, 空 白 组 不 作 处 理, GV492 对照组和 GV492-SOX17 组分别采用相应慢病毒感染细胞 (感染复数=100), 10 mg·L-1 嘌呤 霉素筛选成功感染慢病毒的 PC12 细胞, 荧光显微镜观察各组 PC12 细胞生长状态及绿色荧光表达情 况。采用实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 法检测各组 PC12 细胞中 SOX17 mRNA 表达水平, Western blotting 法检测各组 PC12 细胞中 SOX17 蛋白表达水平。结果:GV492-SOX17 过表达重组质粒的基因 片 段 长 度 约 为 744 bp, GV492-SOX17 过 表 达 重 组 质 粒 基 因 序 列 与 设 计 合 成 的 SOX17 过 表 达 序 列 一 致。GV492 对照慢病毒和 GV492-SOX17 过表达慢病毒滴度均为 2. 5×108 TU·mL-1 。各组 PC12 细胞 生长状态良好且有绿色荧光表达。RT-qPCR法检测, 与空白组和GV492对照组比较, GV492-SOX17 组 PC12 细胞中 SOX17 mRNA 表达水平明显升高 (P<0. 01)。Western blotting 法检测, 各组细胞在相对 分子质量 44 000 处出现特异性条带, 提示 PC12 细胞中 SOX17 蛋白表达成功;与空白组和 GV492 对照 组 比 较, GV492-SOX17 组 PC12 细 胞 中 SOX17 蛋 白 表 达 水 平 升 高 (P<0. 05)。结 论:成 功 构 建 了 GV492-SOX17 慢病毒表达载体, 建立了稳定过表达 GV492-SOX17 的 PC12 细胞系。 [ABSTRACT FROM AUTHOR]