背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长, 但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导 的基因沉默是瞬时表达, 持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应, 利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细 胞系有着可逆的优势, 且可规避上述缺点, 对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体, 研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。 方法:采用RNAi技术, 针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1, sh2, sh3), 将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连 入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞, 并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养, 进行慢病毒包装, 收取48 h及72 h病毒液, 将 其浓缩后感染HEK-293T细胞, 感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡 能力的影响。 结果与结论:①设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3), 均成功连入Tet-on载体, 且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T 细胞;②实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P < 0.05), 且沉默组不加入强力霉素 诱导后目的基因的表达得到回复;③集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P < 0.05);Western blot检测敲低MKRN1 后, 增殖细胞核抗原表达下调, 细胞凋亡相关指标BAX表达增加, Bcl2表达下调, Bcl2/BAX的比值下调(P < 0.001);④结论:采用Tet-on慢病 毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株, 且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖, 并促进其凋亡。通过构建稳定沉默 MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础, 也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。 [ABSTRACT FROM AUTHOR]