SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인에 대한 페이지 디스플레이 유래 신규 인간 단클론 항체의 개발중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2)에 의해 발생한 코로나바이러스 질병 2019 (COVID-19)는 전 세계적인 대유행 상황을 초래하였습니다. 이에 대응하기 위해, 본 연구에서는 페이지 디스플레이를 이용하여 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인 (RBD)에 특이적인 인간 단클론 항체 4종을 개발하였습니다. 특히, SARS-CoV-2 RBD에 특이적인 K102.1 항체는 in vitro에서 강력한 중화 활동을 보여주었으며, 이는 의사 바이러스 및 실제 바이러스 감염에 대한 중화, 그리고 SARS-CoV-2 RBD와 인간 ACE2와의 상호작용 억제를 통한 것으로 확인하였습니다. 더욱이, K102.1 단독 요법을 통한 SARS-CoV-2 감염에 대한 치료 효과를 in vivo에서 보여주었습니다. 본 연구에서는 또한, K102.1과 K102.2로 구성된 경쟁하지 않는 항체 쌍을 활용하여 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 개발하였으며, 이를 통해 SARS-CoV-2 야생형과 변이체의 RBD를 picomolar 레벨의 높은 민감도로 정확하게 감지할 수 있었습니다. 이러한 결과는 지속적으로 진화하는 SARS-CoV-2에 신속한 대응을 위한 단클론항체 개발에 페이지 디스플레이를 활용하는 전략이 효과적일 수 있음을 시사합니다.완전 개방 구조의 스파이크 형태에 특이적으로 결합하여 다양한 SARS-CoV-2 변이체에 높은 중화능을 보이는 신규 이중특이적 인간 항체 플랫폼 개발 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 새로운 변이체가 빠르게 출현함에 따라, SARS-CoV-2에 대해 광범위하게 적용 가능하고 강력한 중화 효과를 지닌 항체 플랫폼 개발이 코로나바이러스 질병 2019 (COVID-19)에 대처하기 위한 높은 수요로 대두되고 있습니다. 본 연구에서는, 인간 합성 항체 라이브러리에서 분리한 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인(RBD)에 특이적인 경쟁하지 않는 페이지 디스플레이 유래 인간 단클론 항체 쌍을 기반으로, K202.B라는 신규 공학적 이중특이 항체를 개발하였습니다. 이 항체는 면역 글로불린 G4-단일 연쇄 변수 단편 형태를 가지며, 나노몰 레벨 또는 그 이하의 항원 결합능 보입니다. 모항체인 단클론항체 또는 항체 칵테일에 비해 K202.B 항체는 다양한 SARS-CoV-2 변이체에 대해 체외에서 뛰어난 중화 가능성을 보였습니다. 또한, cryo-전자 현미경을 이용한 이중특이 항체-항원 복합체의 구조 분석을 통해, SARS-CoV-2의 삼합체 스파이크 단백질의 완전 개방구조의 세 개의 열린 RBD 상태에 결합한 K202.B의 작용 메커니즘이 독립적인 두 개의 SARS-CoV-2 RBD 에피톱을 동시에 연결하는 방식으로 이루어진다는 것을 밝혔습니다. K202.B를 이용한 정맥 내 단일 요법은 SARS-CoV-2 와일드타입 및 B.1.617.2 변이체 감염 마우스 모델에서 강력한 중화 활동을 보였으며, in vivo에서 유의한 독성을 나타내지 않았습니다. 이러한 결과는 이미 설정된 인간 재조합 항체 라이브러리로부터 면역 글로불린 G4 기반의 이중특이 항체를 개발하는 이 신규 접근 방법이, 이중특이 항체의 신속한 개발 및 빠르게 진화하는 SARS-CoV-2 변이체에 대한 적시적인 대응을 위한 효과적인 전략일 가능성을 시사합니다.페이지 디스플레이 유래 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 S2 도메인 표적 항체를 이용한 야생형 및 다양한 변이체에 대한 진단법 개발새로운 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 변이체의 빠른 출현은 계속되는 세계적인 코로나바이러스 질병 2019 (COVID-19) 대유행을 초래하였습니다. 따라서, 다양한 SARS-CoV-2 변이체를 감지할 수 있는 플랫폼의 신속한 개발은 COVID-19에 대한 효과적인 대응을 위해 필수적입니다. 본 연구에서는 페이지 디스플레이 기술을 이용하여 합성 항체 라이브러리로부터 4종의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 특이적 단일 연쇄 변수 단편(scFvs)을 분리하였습니다. 이들 scFvs를 단클론항체 (K104.1-K104.4)로 변환한 후, 동물세포에서 생산 및 정제를 하였습니다. 이후, 물리화학적 특성분석을 통해 가장 높은 결합 친화력을 가진 항체 쌍 (K104.1과 K104.2, 1.3 nM 및 1.9 nM)을 선택하였습니다. 이후, 생화학적 특성 분석을 통해 이 항체 쌍이 스파이크 단백질의 S2 서브유닛의 다른 위치에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였습니다. 또한, 이 항체 쌍을 사용하여 SARS-CoV-2 야생형 및 알파, 베타, 감마, 델타, 카파, 오미크론을 포함한 다양한 변이체의 스파이크 단백질을 피코몰 레벨의 높은 민감도로 정확하고 정량적으로 감지하는 고감도 샌드위치 효소 연결 면역 흡착 검사법을 개발하였습니다. 결론적으로, 본 연구를 통해 개발한 이 신규 페이지 디스플레이 유래 단클론항체는 빠르게 진화하는 SARS-CoV-2의 신속하고 효율적인 감지에 유용할수 있을 것으로 예상됩니다.
Development and Characterization of Phage-Display-Derived Novel Human Monoclonal Antibodies against the Receptor Binding Domain of SARS-CoV-2Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) has resulted in an ongoing global pandemic crisis, caused by the life-threatening illness coronavirus disease 2019 (COVID-19). Thus, the rapid development of monoclonal antibodies (mAbs) to cope with COVID-19 is urgently necessary. In this study, we used phage display to develop four human mAbs specific to the receptor-binding domain (RBD) of SARS-CoV-2. Our intensive in vitro functional analyses demonstrated that K102.1, an anti-SARS-CoV-2 RBD-specific mAb, exerted potent neutralizing activity against pseudoviral and live viral infection and the interaction between SARS-CoV-2 RBD and human angiotensin-converting enzyme 2. Monotherapy with K102.1 also revealed the therapeutic potential against SARS-CoV-2 infection in vivo. Further, this study developed a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay with a non-competing mAb pair, K102.1 and K102.2, that accurately detected the RBDs of SARS-CoV-2 wild-type and variants with high sensitivity in the picomolar range. These findings suggest that the phage-display-based mAb selection from an established antibody library may be an effective strategy for the rapid development of mAbs against the constantly evolving SARS-CoV-2.Novel Bispecific Human Antibody Platform Specifically Targeting a Fully Open Spike Conformation Potently Neutralizes Multiple SARS-CoV-2 VariantsRapid emergence of new variants of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has prompted an urgent need for the development of broadly applicable and potently neutralizing antibody platform against the SARS-CoV-2, which can be used for combatting the coronavirus disease 2019 (COVID-19). In this study, based on a noncompeting pair of phage display-derived human monoclonal antibodies (mAbs) specific to the receptor-binding domain (RBD) of SARS-CoV-2 isolated from human synthetic antibody library, we generated K202.B, a novel engineered bispecific antibody with an immunoglobulin G4-single-chain variable fragment design, with sub- or low nanomolar antigen-binding avidity. Compared with the parental mAbs or mAb cocktail, the K202.B antibody showed superior neutralizing potential against a variety of SARS-CoV-2 variants in vitro. Furthermore, structural analysis of bispecific antibody-antigen complexes using cryo-electron microscopy revealed the mode of action of K202.B complexed with a fully open three-RBD-up conformation of SARS-CoV-2 trimeric spike proteins by simultaneously interconnecting two independent epitopes of the SARS-CoV-2 RBD via inter-protomer interactions. Intravenous monotherapy using K202.B exhibited potent neutralizing activity in SARS-CoV-2 wild-type- and B.1.617.2 variant-infected mouse models, without significant toxicity in vivo. The results indicate that this novel approach of development of immunoglobulin G4-based bispecific antibody from an established human recombinant antibody library is likely to be an effective strategy for the rapid development of bispecific antibodies, and timely management against fast-evolving SARS-CoV-2 variants.Development and Characterization of Phage Display-Derived Monoclonal Antibodies to the S2 Domain of Spike Proteins of Wild-Type SARS-CoV-2 and Multiple VariantsThe rapid emergence of new severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) variants has resulted in the ongoing global coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. Thus, the rapid development of a platform to detect a broad range of SARS-CoV-2 variants is essential for successful COVID-19 management. In this study, four SARS-CoV-2 spike protein-specific single-chain variable fragments (scFvs) were isolated from a synthetic antibody library using phage display technology. Following the conversion of these scFvs into monoclonal antibodies (mAbs) (K104.1–K104.4) and production and purification of the mAbs, the antibody pair (K104.1 and K104.2) that exhibited the highest binding affinity (K104.1 and K104.2, 1.3 nM and 1.9 nM) was selected. Biochemical analyses revealed that this antibody pair specifically bound to different sites on the S2 subunit of the spike protein. Furthermore, we developed a highly sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay using this antibody pair that accurately and quantitatively detected the spike proteins of wild-type SARS-CoV-2 and multiple variants, including Alpha, Beta, Gamma, Delta, Kappa, and Omicron, in the picomolar range. Conclusively, the novel phage display-derived mAbs we have developed may be useful for the rapid and efficient detection of the fast-evolving SARS-CoV-2.