The aim of the current study was to validate an automated chemiluminescent immunoassay for cortisol quantification in saliva and to determine the cut-off level for Cushing´s Syndrome diagnosis in an adult population. The salivary cortisol levels from healthy individuals and patients previously diagnosed with Cushing´s Syndrome were measured with Siemens Immulite 2000 ® automatic chemiluminescent enzyme-immunoassay analyser with a brief modification. The limit of quantification was 3,4 nmol/L. The assay also demonstrated a high level of accuracy, as determined by linearity under dilution and recovery tests. Using this methodology, levels higher than 5.7 nmol/L is indicative of Cushing´s Syndrome with a diagnostic sensitivity and specificity of 90,5% and 97.4% respectively. The assay validated in the present study could be used in the clinical laboratories for the evaluation of cortisol levels in patients in which Cushing´s Syndrome is suspected. Fil: Repetto, Esteban Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Gonzalez, Diego Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina Fil: Jacobsen, Dario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina Fil: Smithuis, Fernando. TCba Salguero Centro de Diagnóstico; Argentina Fil: Jamardo, Juan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; Argentina Fil: Cano, Mariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina Fil: Aranda, Claudio. TCba Salguero Centro de Diagnóstico; Argentina Fil: Oneto, Adriana. TCba Salguero Centro de Diagnóstico; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina Fil: Berg, Gabriela Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Fabre, Bibiana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Hospital de Clínicas General San Martín; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina