Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important cereal crops and staple food of half of the world population. As sessile organisms, rice plants are constantly confronted to a variety of biotic (pathogen infection and insect herbivory) and abiotic (high salinity, drought, and alkalinity) stresses. These stresses causes serious growth reduction, metabolism disruption, and productivity losses in plants. In order to minimize the biological damage caused by the stimulus stresses, it is necessary to understand signaling pathways for adequate defense reactions and increase plant tolerance. Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) is phytopathogenic bacteria causing a serious blight disease in rice. Previously, Os8N3 gene had demonstrated as a recessive resistance gene that makes nutrients easily available to Xoo for its growth and virulence to cause disease. Knockdown of the Os8N3 gene resulted in enhanced resistance to Xoo, while displaying abnormal pollen development. In the first chapter, CRISPR/Cas9 system using genome editing tool was employed to knockout rice Os8N3 in order to confer enhanced resistance to Xoo. Stable transmission of CRISPR/Cas9-mediated Os8N3 gene editing without the transfer DNA (T-DNA) was confirmed by segregation in the T1 generation. With respect to all investigated agronomic traits including pollen development, there was no significant difference between homozygous mutants and non-transgenic control plants under greenhouse growth conditions. Homozygous mutants in both Os8N3 alleles were generated, and the mutations were stably transmitted to later generations. The homozygous T3 mutant plants had normal pollen development, and most pollen grains were well preserved, in comparison with ones from control plants. Saline and alkaline stresses confer severely damage on the photosynthetic apparatus and key factors that could inhibit rice seedling growth and physiological processes. Hypothetical chloroplast open reading frame 3 (Ycf3)-interacting protein 1 (Y3IP1) is a nucleus-encoded thylakoid protein that interacts with the plastid-encoded Ycf3 protein and plays mainly facilitates in the assembly of photosystem I (PSI). Despite the importance of Y3IP1, so far it has not been defined in rice through which regulatory mechanisms Y3IP1 functions under saline and alkaline stress. In the second chapter, therefore, it was confirmed that the transcript level of the OsY3IP1 gene was up-regulated under saline (NaCl) and alkaline (Na2CO3) stresses. For further analysis, transgenic rice lines overexpressing OsY3IP1 (OsY3IP1-GFPox/Kit) was generated to investigate the biological relevance of OsY3IP1. Under saline and alkaline stresses, OsY3IP1-GFP-overexpressing plants compromised the growth retardation of primary roots and maintained higher levels of chlorophyll compared to control plants (Kitaake). In addition, the maximum quantum yield of PSII photochemistry (Fv/Fm) and performance index (PIABS) levels were higher in the OsY3IP1-GFP overexpressing plants than in Kitaake plants under saline and alkaline stress conditions. These results indicated that OsY3IP1 confers enhanced tolerance to saline and alkaline stress. The increased stress tolerance was correlated with reduced reactive oxygen species (ROS) accumulation. These results suggest that abiotic stress tolerance can be improved by less ROS accumulation through the expressional regulation of OsY3IP1 gene. In this study, we have modulated signaling processes of Os8N3 and OsY3IP1 genes to minimize biological damage caused by various biotic and abiotic stresses. Molecular biological studies of Os8N3 and OsY3IP1 as useful genes are thought to suggest how these genes confer resistance to biotic and abiotic stresses on diverse plant species. It is anticipated that future research will support the study of the fundamental response of plants to crop stresses.
벼 (Oryza sativa L.)는 가장 중요한 식량 작물이며 세계 인구의 절반이 섭취하는 주식이다. 작물로써 벼는 지속적으로 다양한 생물적 (병원체 감염 및 곤충 매개 전염) 및 비생물적 (높은 염도, 가뭄 및 높은 알칼리성) 스트레스에 직면 하게 된다. 이러한 다양한 스트레스는 식물의 성장을 감소시키고 식물 대사를 방해하며 생산성을 심각하게 감소시킨다. 따라서 다양한 스트레스로 인한 벼의 생물학적 손상을 최소화하기 위해서는 적절한 방어 반응과 함께 식물 내성을 증가시킬 수 있는 분자적 메커니즘의 조절이 필요하다. Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)는 벼에 세균성 흰잎마름병을 일으키는 세균이다. 이전의 연구들에서, Os8N3 유전자는 Xoo가 식물로부터 영양을 쉽게 섭취하여 질병을 유발하게 할 수 있는 열성 저항성 유전자 (recessive resistance gene)로 입증되어 있으며, Os8N3 유전자가 knock-down된 벼에서 Xoo에 대한 내성을 향상시킨 반면, 비정상적으로 꽃가루가 발달하는 표현형을 보였다. 우리는 대표적인 유전자 교정 기술인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 Os8N3 유전자가 knock-out된 벼 형질전환체를 만들었으며 Xoo에 대한 내성이 향상됨을 확인하였다. CRISPR/Cas9 시스템에 의해서 제작된 T1 세대의 형질전환체들 중에서 삽입되었던 T-DNA는 제거된 채 목적 유전자인 Os8N3가 교정된 라인을 성공적으로 선발할 수 있었다. 온실의 생장 조건 하에서, 꽃가루 발달을 포함한 모든 작물학적 생육 특성이 동형 접합 돌연변이체와 대조군 식물 (Kitaake) 사이에서 차이가 없었다. Os8N3의 두 대립 유전자 동형 접합 돌연변이체가 생성되었고, 돌연변이는 후대에 안정적으로 전달되었다. 동형 접합 T3 돌연변이체 식물 또한 정상적인 꽃가루 발달을 보였으며, 대부분의 꽃가루와 곡물 생성이 대조군 식물의 꽃가루와 비교하여 잘 보존되었다. 높은 염 (NaCl) 및 알칼리 (Na2CO3)를 포함한 비생물적 스트레스는 벼의 생장, 생리 학적 과정 및 광 시스템의 기능을 제한 할 수 있는 주요 요인에 심각한 손상을 가한다. Hypothetical chloroplast reading frame number 3 (Ycf3)-상호 작용 단백질 1 (Y3IP1)은 플라스티드-인코딩된 Ycf3 단백질과 상호 작용하고, 광 시스템 I의 조립에서 필수적인 역할을 하는 핵-인코딩된 틸라코이드 단백질이다. Y3IP1의 중요성에도 불구하고 지금까지 Y3IP1 관련 경로의 분자적 조절 메커니즘은 어떤 작물 및 식물에서도 정의되지 않았다. 이 연구에서는, OsY3IP1 유전자의 발현이 NaCl 및 Na2CO3 스트레스 하에서 상향 조절되는 것을 확인하였고, OsY3IP1-GFP를 과발현하는 형질전환 벼 식물체 (OsY3IP1-GFPox/Kit)를 생성하였다. NaCl 및 Na2CO3 처리 후 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물의 뿌리 길이는 Kitaake 식물보다 길었으며, 엽록소 함량 또한 높은 수준으로 유지되었다. 동일한 스트레스 조건하에서, 광화학 반응의 최대 양자수율 (Fv/Fm) 및 광 시스템 I의 광화학 성능지수 (PIABS)는 Kitaake 식물보다 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물에서 더 높았다. 이러한 결과들을 바탕으로 OsY3IP1 유전자의 발현 조절에 의해 식물의 광합성과 비생물적 스트레스 내성이 개선 될 수 있음을 시사한다. 또한, NaCl 및 Na2CO3 스트레스 하에서 Kitaake 식물에 비해 OsY3IP1-GFPox/Kit 식물에서 활성산소종을 덜 축적하는 표현형을 보았다. 이전 연구결과들에 따르면, 비생물적 스트레스의 증가는 감소된 활성산소종의 축적과 관련이 있다고 보고가 되어 있다. 결론적으로, 핵-인코딩된 틸라코이드 단백질 인 OsY3IP1이 적은 활성산소종의 축적을 통해 염 및 알칼리 스트레스에 대한 식물 반응에서 기능한다는 것을 보여주었다. 본 연구는 다양한 생물학적 및 비생물적 스트레스에 의해 야기되는 생물학적 손상을 최소화하기 위해 Os8N3 및 OsY3IP1 유전자에 의한 신호전달 과정을 조절 하였다. 유용 유전자로써 Os8N3 및 OsY3IP1의 분자 생물학적 연구는 이들 유전자가 어떻게 다양한 종의 식물에 생물학적 및 비생물적 스트레스들에 내성을 부여하는지를 암시할 수 있을 것으로 생각 된다. 이와 관련된 연구는 향후 작물 스트레스에 대한 식물의 근본적인 반응에 대한 연구에 뒷받침이 될 것으로 기대한다.