Metabolic engineering is used to manipulate and analyze metabolic pathway to change the physiology of cells to suit desired purposes. This can improve cell production or synthesize completely new substances through the introduction of heterologous pathway. In particular, the application of metabolic engineering can lead to construction of 'cell factories'. As a candidate for a cell factory, the recently popular species of Pseudomonas putida has advantages such as numerous amounts of coenzymes and has a high resistance to organic substances. However, due to the development of genetic engineering tools is focused on E. coli, there is a lack of tools for genetic manipulation of Pseudomonas species. To overcome this problem, this study focused on optimizing synthetic sRNA systems and tunable gene expression systems developed for E. coli to be used in Pseudomonas putida. We optimize sRNA systems and recently reported fusion sRNA systems that can target multiple genes through various experiments and applied in the protocatechuic acid synthesis pathway for application of metabolic engineering. As a result, the best production strain showed in a three-fold increase in production compared to the wild strains.In addition, a system of constant and phased expression of target genes, regardless of the type of coding sequence, was also optimized for the Pseudomonas putida, which was used to overexpress genes involved in the pathway of protocatechuic acid. As a result, the quiC gene was overexpressed, resulting in a 140-fold increase in production compared to the wild strain. Using optimized genetic tools, it can be easier to construct Pseudomonas putida as cell factory.
대사 공학은 세포 내의 대사 합성 경로를 조작하고 분석하여, 세포의 생리를 원하는 목적에 맞게 바꾸는 데에 쓰이는 공학이다. 이를 통하여 세포의 생산 능력을 향상시키거나, 외래종의 유전자 도입을 통해 완전히 새로운 물질을 합성할 수 있다. 특히, 대사 공학의 적용을 통해 세포의 생산 능력을 폭발적으로 이끌어 내어, ‘세포 공장’을 구축하기도 한다. 세포 공장의 후보로서 최근 각광받고 있는 슈도모나스 푸티다 종은 조효소가 풍부하고 유기 물질에 대한 저항력이 높은 장점을 지니고 있다. 그러나 유전 공학 도구의 개발이 대장균에 많이 치우쳐 있기 때문에, 슈도모나스 종의 유전자 조작을 위한 도구가 많이 부족한 현실이다. 이를 극복하기 위해, 본 연구에서는 대장균에 맞게 개발된 synthetic sRNA 시스템과 tunable gene expression 시스템을 슈도모나스 푸티다 종에서 사용하기 위한 최적화에 집중했다.sRNA 시스템과 최근 다중 유전자를 타겟할 수 있는 fusion sRNA 시스템을 다양한 실험을 통해 최적화하고 이를 실제 대사 공학의 적용을 위해 프로토카테츄산 합성 경로에 관여하는 유전자들을 타겟으로 설정하였다. 그 결과, 가장 좋은 생산 균주의 경우 기본 균주 대비 3배의 생산량 증가를 이끌어 내었다. 또한, 어떤 Coding sequence의 종류에 관계없이 일정하고 단계적으로 타겟 유전자를 발현시켜주는 시스템 또한 슈도모나스 푸티다 균주에 맞게 최적화시켰고, 이를 프로토카테츄산 생산에 관여하는 유전자들을 과발현 시키는데 이용하였다. 그 결과, quiC 유전자를 과발현 시켜, 기본 균주 대비 140여 배의 생산량 증가를 이끌어 내었다. 최적화된 유전자 도구들을 이용하여 추후 슈도모나스 푸티다 종을 세포 공장으로 이용하는 데에 적용될 수 있을 것이다.